荧光定量原理与应用幻灯片.pptVIP

北京元业伯乐科技发展有限公司 PCR概念 定量PCR 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？？？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化 荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图 定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值 定量原理 Ct值的概念 为什么要用Ct值定量 阈值选择 阈值的选择 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 Absolute（绝对定量） Determines input quantity of a nucleic acid target Requires a standard curve Relative（相对定量） Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samples Performed with or without a standard curve Typically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene Quantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acid At least 2 concurrent standard curves are used One for gene(s) of interest At least one for reference gene Standard curves account for reaction efficiencies 关于SYBR Green I 一种最基础的实验手段 材料和方法 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA RNA + no reverse transcriptase 材料和方法 材料和方法 50oC,30min 95oC,15min 94oC,15sec 60oC,1min plate read go to step 3,39 more times 10oC,forever End 实验结果 讨论 SYBR Green I 融解曲线分析 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量方法 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析 实时荧光定量PCR技术简介： 表达差异 基因表达差异分析（替代Northern Blot)： responses to a particular stimulus tissue differentiation stages of development cell proliferation disease state progression 研究方面部分应用 Two-color-real-time qPCR assay for Cancer marker expression using TaqMan? probes 应用实例 Cancer marker expression TaqMan chemistry Multiplexing Expression differences of ERBB2 in neoplastic breast tissue samples Cancer marker expression ERBB2 oncogene Transmembrane tyrosine kinase overexpressed in ~25 % of breast cancer cases Increased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatments GAPDH houseke