大鼠肾缺血再灌注损伤后血清TNFαIL 6及Bcl 2Fas表达变化意义.docVIP

大鼠肾缺血再灌注损伤后血清TNFαIL 6及Bcl 2Fas表达变化意义 　　【摘 要】目的 探讨大鼠肾缺血再灌损伤后血清中TNF-α、IL- 6的变化以及Fas、Bcl- 2蛋白在肾小管上皮细胞中表达的变化，并分析在AKI发病机制中的作用。方法 用无损伤动脉夹钳夹大鼠双侧肾蒂40min制成IR I动物模型。观察缺血再灌注（IR）后2h、6h、12h、24h、48h血清中TNF-α、IL- 6的变化（ELISA法）及SCr的变化（苦味酸法）和以上各灌注时间点肾脏的病理变化（HE染色）以及IR后12h Fas、Bcl- 2蛋白的表达情况（免疫组化法）和与肾小管上皮细胞凋亡的关系（TUNEL法）。结果 肾小管上皮细胞凋亡在IR后12h明显增加，以皮髓交界区明显，阳性细胞率（%）为77.74±5.00%，而假手术组（Sham组）阳性率（%）为2.03±0.82%，两组差异具有显著性（P0.01）；血清TNF-α、IL- 6在IR后12h含量明显增高，分别为130.58±36.57、352.70±58.32（pg/ml），并与SCr的升高对应；Fas在IR后12h肾小管上皮细胞阳性率（%）为83.23±2.22%，Sham组阳性率（%）为3.02±0.82%（P0.01）；Bcl- 2在IR 12h组及Sham组中肾小管上皮细胞阳性率（%）分别为0.40±0.05%、2.00±0.90%，差异具有显著性（P0.01）。结论 TNF-α、IL- 6参与了AKI的病理生理过程；TNF-α可能通过上调 Fas和下调Bcl- 2参与对肾小管上皮细胞的凋亡调控。 　　【关键词】缺血-再灌注损伤；细胞凋亡；TNF-α；IL- 6；Bcl- 2；Fas 　　缺血-再灌注损伤是导致急性肾损伤（Acute Renal Injury，AKI）的常见原因之一。肾脏缺血再灌损伤早期的细胞死亡在AKI的发生机制有关键作用[1-2]。现代医学已得出结论，Bcl-2、Bax、Fas等凋亡调节蛋白及许多炎症因子如TNF-α、细胞因子及生长因子会在细胞凋亡过程中发挥重大影响[3-5]。凋亡肾小管上皮细胞在AKI中的病理生理作用及形态学改变尚不完全清楚。本实验以缺血再灌损伤的动物模型从分子水平进一步探讨急性肾损伤中肾小管上皮细胞Bcl-2、Fas蛋白表达及血清中TNF-α、IL-6的变化对细胞凋亡的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 SD大鼠，雌雄不拘，体重100～120g，细胞凋亡检测试剂盒，Fas免疫组化染色试剂盒、Bcl- 2免疫组化染色试剂盒，大鼠TNF-αELISA试剂盒， 大鼠IL- 6 ELISA试剂盒（美国BPB Biomedical）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肾缺血再灌注（IR）动物模型制备SD大鼠放在室温为18～22℃的环境下按日常标准喂养。2%戊巴比妥钠30～40mg/kg腹腔内注射，腹部正中线切口，用无损伤动脉夹钳夹双侧肾蒂40min造成缺血-再灌注损伤动物模型，松开后观察到大鼠肾脏由颜色变成鲜红，即灌注成功。处理好伤口之后照常标准喂养。依次在模型建立之后2小时、6小时、12小时、24小时、48小时分批处死动物，心脏采血检测TNF-α、IL-6、SCr。采集血样后马上将左侧肾脏摘下来，用4%多聚甲醛固定后作常规石蜡包埋切片。假手术组（Sham组）仅暴露双侧肾脏，不钳夹肾蒂，其余处理方式相同。 　　1.2.2 实验分组48只健康、雄性SD大鼠，随机分为6组（每组8例）：_ Sham组；_ IR2h组；_IR6h组；_IR12h组；_ IR24h组；_IR48h组；实验方法同上。 　　1.2.3 肾小管上皮细胞凋亡的检测取HE染色切片相邻的切片常规脱蜡入水，并按试剂盒流程处理，用显微镜观察。肾小管上皮细胞核中出现的棕黄色颗粒就是阳性细胞，即凋亡细胞。检测结果分析：随机选取5个200倍清晰视野，并采用图像分析仪计数视野中的细胞总数及阳性细胞数，然后得出每张切片的阳性细胞百分率。 　　1.2.4 采用SABC免疫组化法检测肾小管上皮细胞中Fas及Bcl-2表达水平肾小管上皮细胞膜或胞浆着色呈棕黄色者为Fas阳性细胞；肾小管上皮细胞浆着色呈棕黄色者为Bcl-2阳性细胞。检测分析同上。 　　1.2.5 肾功能采用Beckman全自动生化分析仪检测SCr，苦味酸法。 　　1.2.6 血清TNF-α、IL-6测定每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值；标准品浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，用线连接个标点，通过标本的OD值就可查出其浓度。 　　1.3 统计学处理 　　应用SPSS 11.0统计软件包处理数据，计量资料进行t检验，计数资料采用χ2检验，P?0.05认为有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1