大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法建立.docVIP

大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法建立 　　摘 要 以大肠杆菌O157∶H7 （E. coli O157∶H7）rfbE基因为靶基因，建立了可对其准确定量的微滴数字PCR（ddPCR）方法。对ddPCR反应中的探针浓度进行了优化，考察了方法的线性范围、精密度、定量限和检出限。最终确定ddPCR反应中的最佳探针浓度为300 nmol/L。E. coli O157∶H7基因组DNA浓度范围为4～1.25×105拷贝/20 μL ddPCR反应液时，ddPCR方法线性相关系数（R2）为0.999。当DNA浓度为760～88400拷贝/20 μL时，方法的精密度最好（RSD5%）。本方法的定量限为4拷贝/20 μL，检出限为3拷贝/20 μL。特异性验证结果表明，建立的ddPCR方法特异性良好，对13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测结果与定量PCR方法检出结果一致。 　　关键词 微滴数字聚合酶链式反应； 大肠杆菌O157∶H7； 拷贝数 　　1 引 言 　　大肠杆菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）是肠出血性大肠杆菌常见的血清型，是以食物为主要的传播途径的致病菌，牛、羊、猪和鸡等家畜家禽是其主要宿主[1，2]。可引起严重并发症， 甚至导致死亡，死亡率可达5%～10%。近年，肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染在世界各地都有不同规模的爆发和流行，在世界范围内都受到普遍关注。此外，E. coli O157∶H7的感染剂量极低，在食入不足10个细菌就可能引起疾病[2，3]。目前还没有一种特效药或有效的治疗手段，因此建立快速、有效的检测方法对E. coli O157∶H7的预防工作显得尤为重要。 　　目前，检测肠出血性E. coli O157∶H7的方法可分为传统方法、免疫方法和分子检测方法。传统的分离培养法和生化鉴定时间长，灵敏度低； 免疫学方法虽然检测时间相对较短[4]，但是容易发生于大肠杆菌的多种血清型的交叉反应。刘霞等[5]采用纳米金标记抗体增强表面等离子体共振（SPR）传感器对E. coli O157∶H7进行检测。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链式反应（PCR）方法被广泛用于E. coli O157∶H7 疾病的快速诊断中。实时荧光定量PCR（Real time quantitative PCR，qPCR）[6，7]技术以其特异性强、灵敏度高、速度快等优点在基因表达、病原体基因检测等方面得到广泛应用，已经成为当前细菌快速检测的重要方法，并已成功用于不同来源的E. coli O157∶H7的检测中[8～12]。如Fratamico等[10]建立了不同食品中针对stx1、stx2、wzyO157、eae和 fliC目标基因检测E. coli O157∶H7的多重定量PCR方法。Bonetta等[12]建立了一步富集法结合PCR方法检测地表水中的E. coli O157∶H7，解决了由于方法灵敏度的限制而难以检测地表水中的E. coli O157∶H7，检测限低至3 CFU/L。 　　微滴数字PCR方法（Droplet digital PCR， ddPCR）是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数[13～15]。本方法无需依赖外部核酸标准，可实现核酸绝对定量分析。ddPCR与qPCR方法相比，本方法无需核酸标准品，又兼具qPCR方法的优点，用于环境微生物[16]和病原体基因的检测具有更广阔的应用前景。因此， 研究和建立E. coli O157∶H7的ddPCR方法，对E. coli O157∶H7的快速、 准确的定性和定量检测具有重大意义。本研究在之前建立的qPCR方法[17]基础上，进行ddPCR检测E. coli O157∶H7方法的建立和优化。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Nanodrop 2000超微量紫外分光光度计（美国赛默飞世尔公司）； Roche Light Cycle 480实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏诊断公司）； QX100微滴式数字PCR仪（美国伯乐公司）。 　　E. coli O157∶H7（ATCC 35150）、志贺氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等非大肠杆菌菌株和5 株非O157∶H7 血清型大肠杆菌基因组DNA由北京基因组研究所提供。实时荧光定量PCR试剂盒（美国Life Technology公司）。微滴数字PCR定量试剂盒（美国伯乐公司）。肉类样品购自本地超市和集贸市场。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 引