大苞雪莲石油醚部位对缺氧大鼠脑组织保护作用及其机制研究.docVIP

大苞雪莲石油醚部位对缺氧大鼠脑组织保护作用及其机制研究 　　[摘要] 目的：研究大苞雪莲石油醚部位（petroleum ether extract of Saussurea involucrata，PESI）对常压密闭缺氧大鼠脑组织的保护作用及其机制。方法：首先采用常压密闭缺氧模型进行缺氧大鼠的PESI剂量依赖性实验，给药剂量分别为125，250，500 mg?kg-1，单次腹腔注射给药，最终确定的最佳给药剂量为PESI高剂量。然后取90只雄性Wistar大鼠随机分为缺氧模型组、乙酰唑胺250 mg?kg-1组和大苞雪莲石油醚部位高剂量组，每组又按不同缺氧时间分为3个亚组，各亚组10只大鼠。采用与上述相同的方法缺氧和给药，并于缺氧处理0，3，6 h后处死大鼠，取脑组织进行常规组织学观察和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）免疫组化染色，并用Real-time RT-PCR检测HIF-1α，促红细胞生成素（EPO），血红素加氧酶（HO-1）和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）基因表达情况，用蛋白印迹法检测HIF-1α蛋白的表达情况。结果：缺氧模型组脑组织随缺氧时间的延长而出现严重的病理损伤，乙酰唑胺组和PESI高剂量组的损伤情况则明显减轻。基因表达和蛋白印迹检测均发现，PESI高剂量抑制HIF-1α的表达，单纯基因表达检测发现，PESI高剂量增强EPO和HO-1 mRNA的表达，但抑制Caspase-3 mRNA的表达。结论：PESI对常压密闭缺氧大鼠脑组织的保护机制可能与其抑制HIF-1α表达、增强血液输氧能力和抗脑细胞凋亡有关。 　　[关键词]大苞雪莲；缺氧；缺氧诱导因子1α；促红细胞生成素；血红素加氧酶；Caspase-3 　　随着我国西部大开发战略的深入实施、青藏铁路的开通和高原旅游业的兴起，越来越多的人需要在较短时间内由平原进入高原，但急性高原反应（acute mountain sickness，AMS）严重影响进入高原人群的身体健康，有时甚至危及生命。为此，研制抗AMS的新型药物已成为摆在医药工作者面前的一项十分紧迫的任务。前期研究中已发现青藏高原特有植物大苞雪莲具有良好的抗缺氧活性，并发现石油醚提取物（petroleum ether extract of Saussurea involucrata， PESI）是其活性成分的富集部位[2-3]。文献报道大苞雪莲的化学成分主要有黄酮、生物碱、香豆素类、木质素类和倍半萜内酯类等[4]，具有多种生物活性，但有关抗缺氧作用方面的研究却少有报道。为研究PESI抗缺氧机制，以便为研制抗AMS新药提供思路，以对缺氧极为敏感的脑为研究对象，探讨了PESI 对脑组织中几种与抗缺氧密切相关的蛋白质的表达的影响。 　　1材料 　　1.1动物 健康Wistar大鼠，雄性，体重180～220 g，购自甘肃中医学院动物实验中心，饲养于兰州军区总医院实验动物中心，适应性饲养3 d后用于实验。动物饲养及实验环境均为SPF清洁级实验室，层流空气净化，恒温（22±2） ℃，相对湿度40%～60%，自由摄食及饮水。 　　1.2药物 大苞雪莲购自青海西宁三江宝商贸有限公司，经兰州大学药学院杨永建教授鉴定。大苞雪莲石油醚部位：称取大苞雪莲粗粉，加入10倍量70%乙醇，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，合并提取液，减压浓缩至浸膏，将浸膏用3倍量水分散，依次用相当于水分散体系1/3体积的石油醚萃取至萃取液近无色，合并各萃取液，减压干燥，得石油醚部位，临用前加适量聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80），边研边加蒸馏水，配制成混悬液；乙酰唑胺（武汉远城科技发展有限公司，批。 　　1.3仪器与试剂 紫外-可见分光光度计（惠普公司）；MLS-3020高压蒸汽消毒锅（口本Sanyo电器公司）；水浴锅（上海医疗器械七厂）；高速离心机（德国Appendorf公司）；Milli-Q去离子水制备仪（Millipore Ltd）；Delta 320电子pH计（Mettler Toledo Ltd）；DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）；Harris 80 ℃冷柜（Harris Manufacturing Co.）；恒温摇床（上海离心机研究所）；钠石灰（Molecular Products Limited公司，英国）；RNAiso Reagent，TakaRa Prime ScriptTM reagent Kit，PCR扩增试剂盒（大连宝生物公司）；引物由宝生物工程公司合成；HIF-1α单抗（Abcom公司），二抗（武汉博士德生物工程有限公司）和ECL试剂盒（Upstate公司）；β-actin单抗、二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 　　2方法 　　2