生物化学实验-酵母RNA的分离、组分鉴定及含量分析1.ppt

酵母RNA的分离、组分鉴定 及含量测定 1、掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2、了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。 3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。 [实验目的] 为何选用酵母为材料提取RNA? 酵母核酸中主要是RNA2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌体易收集，RNA易分离。 从酵母中提取RNA常用方法 稀碱法:利用稀碱使细胞壁溶解,时间短，但RNA易分解。 浓盐法:加热条件下，利用高浓度盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，产品色泽较好。 本实验用0.2% NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA 。 1. 核酸分离 [原理] 酶促水解 化学水解: 酸水解:碱基、核糖/脱氧核糖和磷酸 碱水解:RNA存在2′-OH，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸 核酸水解方法 2. 组分鉴定 RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成，提取得的 RNA 中加10% 硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液 （$），分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。 [原理] 磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀 (1mL $ + 1mL定磷试剂)： (NH4)2MoO4 + H3PO4 → (NH4)3PO4·12MoO3↓(黄色) Mo6+ SnCL2 Mo4+ Mo(MoO4)2 (兰色) 嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物 (1mL $ + 过量氨水 + 1mL 0.1M的AgNO3)。 ② 核糖与地衣酚(orcin)试剂反应呈鲜绿色 (1mL $ + 1mL FeCl3 + 2mL orcin→水浴加热) 3. RNA含量测定 核酸（DNA和RNA）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，吸收高峰在260nm波长处，蛋白质则在280nm波长处。 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml 纯DNA：OD260/OD280≈1.8 (＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0 （＜1.7时表明有蛋白质或酚污染,可以增加酚 /氯仿抽提） OD260/OD280的比值用于估计核酸的纯度,OD260/OD230估计去盐的程度。 对于RNA纯制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230应大于2。 OD260/OD2302说明去盐不充分, 可以再次沉淀和70%乙醇洗涤。 浓度计算： DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000 1．提取 称取干酵母粉0.4g，放入试管中，加入0.2% NaOH 3mL，然后放入沸水浴中提取15min。 2．分离 用自来水冷却,滴加1-4滴醋酸，调pH至6.0（沉淀蛋白质），装入离心管配平，3000r/min离心3min，（使提取液与菌体残渣分离）。 3．抽提 收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混匀，3500r/min离心5min。 4．沉淀RNA 收集上清，平均分装入两支离心管中，各加2倍体积无水乙醇，边加边搅拌，配平，3500r/min离心5min，得到RNA沉淀。 弃去上清液（弃净），一支离心管加5mL蒸馏水回溶，以备浓度测定；另一支离心管加入5mL 10%的 H2SO4 ，然后将沉淀转入50mL三角瓶中，待用。 [操作步骤] 注意配平、对称放置离心管 ①RNA的酸解 将装有待测RNA的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明为止，得到RNA的水解液，期间不停晃动，以使受热均匀。 [注意] RNA加热酸解时，一定注意观察，本步很容易加热过度，使透明溶液变成黑褐色，而导致实验失败。 5.RNA的组分鉴定 检验项目 嘌呤 核糖 磷酸 水 解 液 1mL 1mL 1mL 试 剂 NH3·H2O 2mL AgNO3 1mL 苔黑FeCl3 1mL 定磷试剂 1mL SnCl2 1-2滴 反应条件 不振动 观察现象 沸水浴约10min 振荡混匀 室温放置 现 象 白色絮状沉淀 鲜绿色 兰色 ②组分鉴定 加蒸馏水将水解液稀释至5mL，然后按下表检验项目所需的量分装三支试管中，进行组分鉴定。 待测样品适当稀释（如量取100μL RNA水溶液，加2900μL 蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其230nm、260nm 和