超氧化物歧化酶的定向进化－东北师范大学.pptVIP

超氧化物歧化酶的定向进化 指导教师：张 今教授 DNA重组技术的发展出现了基因工程，定点突变技术的出现诞生了蛋白质工程，在基因工程和蛋白质工程的基础上，DNA shuffling技术的应用，出现了分子进化工程。1999年5月12日-15日 在美国由5000多名生物技术专家参加的会议上，定向进化被认为是达尔文进化论在分子水平的体现，是一场进化革命，引起各国科学界和企业界的高度重视。在实验室中模拟几百万年来发生在自然界中的漫长的进化过程，这种思想很快的得到了实验的支持和广泛应用。 基 本 原 理 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。定向进化的关键在于“变”和“筛”的方法。 目前存在的问题 （1）天然酶在现存的工业条件下（例如在有机相、极端温度和pH）的稳定性较差或其催化水平很低； （2）天然酶在工程菌中的折叠效率较差或对蛋白酶敏感； （3）酶的催化范围需要扩大或减小； （4）需要创造具有新反应活性的酶； 研 究 策 略 酶法体外随机-定位诱变； 易错PCR技术为代表的无性进化； DNA shuffling为代表的有性进化； 基因家族之间的同源重组； 外显子改组； 模块酶与杂合酶技术； 细胞定向进化； 博士期间主要从事的工作 人Cu,Zn-SOD筛选模型的建立及采用易错PCR和交错延伸技术的进化； 人Cu,Zn-SOD与肝素亲和肽的杂合酶； 人EC-SOD与人Cu,Zn-SOD的杂合酶。 拟解决的问题： 一、突变库的建立 改进的易错PCR方法： MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对； 加入0.5mmol/L MnCl2降低聚合酶的特异性； dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入； Taq DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。 交错延伸策略； 二、筛选方法的确立 目前只有在酶水平上的活力测定方法； 我们获得了一株sodAsodB双缺陷菌株QC779； QC779菌株体内的O2-富集，导致二羟酸脱水酶失活，造成分枝氨基酸Val，Leu，Ile合成受阻。 QC779菌株只有获得超氧化物歧化酶活力，才能在基本培养基上生长。 三、高氧压力的获得 Paraquat属于紫精类化合物，化学名为1,1?-二甲基-4,4?-联吡啶，其化学结构如下： 实验结果 筛选结果的讨论： 细胞水平 基因水平 酶水平 野生型的活力为1140U/mg蛋白，而突变体的活力1280U/mg蛋白； 常氧压力下酶活力没有明显差别；高氧压力下突变体具有明显的生长优势； 原因主要有两个： 1、测定时与生理状态pH值不一样； 2、测定状态与高氧压力时底物浓度不一样。 小 结 我们成功建立了SOD的高效筛选模型 ； 环境是影响进化结果的一个重要因素，这或许是我们在正常的氧压力下选择不到优势突变体的一个原因 。 第二部分 人Cu,Zn-SOD与肝素亲合肽的杂合酶研究 人Cu,Zn-SOD基本性质； 人Cu,Zn-SOD负责催化： E-Cu(II) + O—.2 →E-Cu(I) + O2 E-Cu(I) + 2H+ + O—.2 →H2O2 人Cu,Zn-SOD的临床应用： 治疗自身免疫性疾病； 治疗心肌缺血与缺血再灌流综合症； 治疗某些心血管疾病； 抗衰老的研究； 天然SOD作为药用酶用于临床受多种因素的影响: (1)半衰期短，在体内停留时间通常只有6-10分钟； (2)分子量在32000左右，不易透过细胞膜； (3)如果口服，易受蛋白酶水解而失去活性； (4)体内特异等。 为解决上述不利因素，国内外主要用分子工程方法对SOD进行分子修饰，或做成脂质体。 RT-PCR扩增HCu,Zn-SOD基因； 构建含肝素亲和肽的重组质粒； 表达与纯化； 部分理化性质测定。 肝素亲和肽重组质粒的构建 Figure 15 Heat stability of SOD Closed circles: HBSOD; Open circles: native SOD Figure 16 heparin-agarose chromatograph of HBSOD. the enzyme eluted at a concentration of approx 0.4M NaCl 小 结 采用RT-PCR的方法从人胎肝组织中钓取到了人铜锌超氧化物歧酶的cDNA片段，建立了一种提高克隆效率的方法； 构建了人铜锌超氧化物歧化酶的高效表达载体pBVSOD并成