RNA干扰技术和siRNA药物.pdf

RNA 干扰技术与 siRNA 药物 RNA 干扰 （RNA interference，RNAi）是指内 源性或外源性短链RNA 诱导同源mRNA 降解，导致基 因沉默的现象。RNAi 被认为是目前国际上最具潜力 的一种基因治疗方法。从理论上讲，几乎所有涉及基 因异常高表达的人类疾病都有可能设计出相应的 siRNA 来沉默疾病相关基因，从而达到治疗目的。 2001年和2002 年，RNAi 技术连续两次被《Science》 杂志评为当年十大科学成就之一，安德鲁·法尔和克 雷格·梅洛两位科学家因在RNA 干扰领域的突出贡献 获得2006 年度诺贝尔生理学或医学奖。 RNAi 介导的特定基因沉默的有关机制发生在转 录后水平，故称为转录后基因沉默 (PTGS)。在起始阶 段，外源性短双链RNA (dsRNA) 进入细胞被一种称为 Dicer 的酶识别，该酶可将dsRNA 切成长度为21~23 nt ( 核苷酸) 的小片段RNA，即小干扰RNA (siRNA)。 在效应阶段，siRNA 结合一个核酶复合物从而形成 RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC 在ATP 供能的情况下将携带 的siRNA 解螺旋而激活。激活的RISC 通过碱基互补 配对与同源mRNA结合，并在距离siRNA 5’端10-11 bp的位置切割mRNA。断裂的RNA小分子在核酸酶的作 用下被降解，从而导致特定基因的沉默。 研究发现在哺乳动物中导入dsRNA 会引起严重 的细胞毒性反应，但利用人工合成的21nt双链siRNA 可成功转染体外培养的人胚肾293细胞和Hela 细胞。 随后，在体外培养的鼠源、灵长类及人源细胞中均证 实存在siRNA 启动的RNAi 效应，并且siRNA 可以启 动较dsRNA 更高效的基因沉默现象；表明siRNA 可能 是直接启动RNAi 的结构单元，目前药物开发也主要 是针对siRNA 的研究。由于RNAi 技术可用于特异性 降低或沉默某些致病基因的表达，因此RNAi 类药物 在人类疾病治疗中的应用前景广阔，发展潜力巨大。 RNAi 药物研发的一般技术路线是：确定目的基 因，设计 siRNA 序列，获得 siRNA 产物，siRNA 转 染，RNAi 效果检测。 （1）siRNA 序列设计 siRNA 序列设计一般遵循以下原则：① siRNA的 长度一般为21~23 nt；②由于RNAi 的高特异性， siRNA 在序列上必须与靶标基因mRNA 序列完全一致； ③避免选择起始密码子下游50~100nt、终止密码子上 游100nt以及5’和3’非编码区(UTR) 的序列；④ siRNA 5’端必须磷酸化，3’端最好悬挂2个dTdT； ⑤对siRNA 适当的化学修饰可增加其在体内的稳定性。 如磷酸骨架修饰、核糖修饰、碱基修饰等。 （2）siRNA 的给药途径 1）局部给药：:目前用于局部给药的有：玻璃体内注 射给药治疗眼病；鼻内给药治疗呼吸道合胞病毒 (RSV)；瘤内注射针对实体瘤；肌内注射治疗肌肉组 织疾病等。局部给药药物可直接作用于靶器官，降低 siRNA 被核酸酶降解的概率，并可减少siRNA 的药物 使用剂量。 2）全身给药：全身给药主要采用口服、皮内或静脉 注射。全身给药可用于治疗全身性疾病，但需要较多 的siRNA 以使靶器官或靶组织获得有效的药物浓度。 同时，siRNA 需要有较高的靶向性和稳定性，能有效 地被靶细胞吸收而不被破坏。近年研究采用对siRNA 进行化学修饰、纳米颗粒包埋 等方法有效避免siRNA 在体内的降解，促进细胞对siRNA 的摄取。同时，使 用抗体Fab 片段或配体与siRNA 结合 以及病毒载体 等方法可使siRNA 特异性地与靶细胞结合，提高其在 体内的利用率。全身给药已成为当前siRNA药物主要 的给药途径。 （3）siRNA 安全问题及解决方法 1）脱靶效应 (off-target)：是指由siRNA通过RNAi 机制作用于非靶mRNA导致的非靶基因沉默现象。一般 来说RNAi对靶基因的沉默是高度特异性的，但近来研 究发现，合成的siRNA分子在哺乳动物体内亦会产生 脱靶效应。siRNA可产生两类 “脱靶”效应，一类由 siRNA进入miRNA通路引起的，siRNA可发挥miRNA功能， 通过部分匹配，尤其种子区匹配使许多基因表达量下 降，引起脱靶效应，这种脱靶效应