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水稻基因组DNA提取方法研究进展 　　摘要：水稻基因组DNA的提取方法主要有SDS法和CTAB法。在此基础上又提出了快速制备法、简易提取法、无需液氮研磨提取法、微量提取法等多种方法。从试验提取材料、方法等方面对以上各种方法的优缺点及应用范围进行了综述。 　　关键词：水稻；基因组DNA；提取方法 　　中图分类号：S511；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2010)04-0968-04 　　 　　水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一，已被列为模式作物，有着丰富和深入的基因组研究基础。其DNA的制备是深入进行分子生物学研究的前提。为使所得DNA纯度高，断裂降解程度小、量足，在提取时应根据不同研究需要，保证其结构的相对完整性；尽量排除其他大分子成分如蛋白质、多糖等的污染。前人已就植物基因组DNA的提取总结了一系列的方法，如SDS法、CTAB法。但在DNA提取过程中，有机试剂处理次数过多，所得DNA分子片段偏小，纯度不高，得率也低。且CTAB等试剂价格昂贵，增加了成本。目前，针对不同的研究目的和试验需要，提取水稻基因组DNA的材料和方法的侧重点不尽相同，各有其优缺点。 　　 　　1　材料 　　 　　目前提取水稻基因组DNA所用的材料主要有：水稻干种子、幼嫩茎段、叶片、幼穗老叶、发芽幼苗等。不同材料对提取的DNA纯度和浓度以及所适用的范围也不同。研究表明，植物组织中的多糖及其他一些次生代谢产物，如脂、萜等。会对DNA的提取造成很大的困难，而且这些物质的含量随植物组织器官的生长而增加，如果不能有效地去除，植物组织中的酚类物质会氧化成醌，溶解在抽提液中与蛋白质、DNA结合。影响DNA的解链或降低Taq酶的活性。而使提取出来的DNA限制性内切酶无法酶切。所以，在DNA的提取过程中必须将酚类、多糖和蛋白质等化合物除去。为了避免上述物质的影响。在选取材料时，应尽可能挑取处于生长旺盛期的幼嫩组织。所以在以往的研究中大多数学者都以水稻新鲜叶片或幼苗或水稻幼嫩茎段作为提取材料。但在进行品种鉴定和纯度分析时，用新鲜幼叶或幼苗提取DNA，不仅费时费成本，而且需要液氮。而用水稻单粒种子制备水稻DNA与幼叶相比较其操作简便，省时省力且具有良好的重复性。一般来说DNA提取效果以愈伤组织和幼叶最佳，比如在采用剪切法提取DNA时，以幼穗为材料所提取的DNA纯度比幼叶及老叶提取的质量要高，PCR效果较好。从所提取的DNA浓度和质量方面来比较，幼叶提取的DNA浓度较高，需要稀释后才可用，而单粒种子所提取的DNA质量和浓度适中，DNA条带清晰，没有降解，可直接用于PCR扩增。 　　 　　2　提取方法 　　 　　2.1传统提取法 　　2.1.1 SDS法这种提取方法利用高浓度的离子去污剂SDS使DNA与蛋白质分离，在高温(55-65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析。蛋白质变性，离心后除去沉淀。上清液用酚／氯仿抽提后用乙醇沉淀液相中的DNA。与CTAB法相比，SDS法步骤简单，用时少，但DNA纯度低，扩增效果差，也用到了一些对人体有害的试剂，安全性不高。但相对于其他快速简易提取法，其步骤还是繁琐、时间长。因此，不能满足现代分子生物学研究中大批量组织DNA分析的需要。为此。有学者在SDS方法的基础上提出了剪切法、液氮法和钢珠法。这3种方法的步骤大致相同，原理相通，主要不同点在于对叶片的破碎方法。三者中剪切法和液氮法提取的基因组DNA的条带亮度高，钢珠法低。而且剪切法不需要研磨，不需要灭菌，节省时间，不用液氮研磨，节省成本，同时避免了研钵中残留物的污染，提取的数量多，PCR结果稳定，重复性也好，所以经济实惠，是实验室提取水稻基因组DNA的一种好方法。在其操作步骤中，65％水浴过程很重要，时间过短，则DNA得率不高，时间过长则由于DNA酶的作用很容易造成DNA的降解。若只需少量的DNA，水浴时间可以缩短。水浴过程中要尽可能让SDS充分与材料反应，尽可能完全地破碎细胞膜，释放DNA，所以必须不时将反应体系轻轻颠倒混匀。 　　2.1.2 CTAB法CTAB法也是目前应用比较广泛的传统提取方法，其提取质量和产量都比较高。以水稻干种子为材料，采用CTAB法提取得到的DNA，经过纯化和RNA酶处理，纯度较高，显示一条清晰的DNA带：从RAPD扩增结果看，CTAB法获得的模板DNA，每个引物均可扩增出清晰的条带。但此方法操作非常繁琐。耗时耗力，所用试剂对人体有毒，且成本较高。针对其操作繁琐等缺点，在此基础I-3L发展起一种快速简单的方法，35 min之内提取到基因组DNA。该方法在CTAB抽提液的用量及加入氯仿／异戊醇离心的时间和次数等方面有所改进。它秉承了CTAB法高产率、高纯度的优点，同时又大大简化了CTAB法繁杂的操作过程。此方法操作简