水稻bHLH转录因子Os11g39000功能研究.docVIP

水稻bHLH转录因子Os11g39000功能研究 　　摘要：水稻Os11g39000 为非典型的bHLH家族成员，其功能尚不清楚.酵母双杂交实验表明，转录因子Os11g39000可以形成同源蛋白聚合体.随机结合位点筛选实验表明，转录因子Os11g39000可以与DNA结合，并且其结合位点初步确定为TT/CG/CACC/GT/C.Os11g39000基因的组织表达模式分析发现，Os11g39000基因主要在叶片和根中表达，推测该基因可能在叶和根的发育调控中发挥作用.水培实验发现，该基因功能缺陷型转基因株系的根长显著短于野生型，表现出明显的根部发育缺陷，表明Os11g39000在水稻根的发育中起调控作用.QPCR分析进一步证明，功能缺陷型转基因植株体内生长素合成和信号转导相关基因表达量显著上升，表明转录因子Os11g39000参与了水稻生长素的合成和信号转导的调控. 　　关键词：水稻；bHLH转录因子；Os11g39000；生长素 　　中图分类号：S601 文献标识码：A 　　转录因子（tarnscription factor， TF）是能够与目的基因上游特定DNA序列结合的蛋白质，又被称为反式作用因子，通过与顺式作用元件相互作用，从而保证目的基因以特定强度在特定时间与空间表达的蛋白质分子[1].bHLH（basic HelixLoopHelix， 碱性螺旋环螺旋）转录因子是真核生物蛋白质中的一个大家族，其成员在动植物界行使着多种重要的功能.例如，一个bHLH蛋白BPEp可以通过与生长素应答因子ARF8相互作用调控拟南芥花蕊的早期发育[2].研究发现bHLH在光敏色素的信号转导，细胞分化，应答油菜素内酯的基因表达等过程中都起着重要作用[3-5]. 　　典型的bHLH结构域包含大约60个氨基酸，由位于bHLH结构域N端能够结合DNA的basic区域和HLH区域组成[6].HLH区域包含两个α螺旋，通过它们bHLH蛋白可以相互作用，形成同源或者异源蛋白聚合体[1， 7-8].一类以人类Id蛋白为代表缺少basic区域的HLH蛋白虽然不能够与DNA直接相互作用，但是可以通过与其它bHLH蛋白的HLH区域形成特异的异源蛋白聚合体来抑制相应bHLH转录因子的活性[9-10].通过抑制像E这样的bHLH蛋白，从而在细胞分化和发育过程中起到关键作用[11].在拟南芥中，发现一个HLH蛋白KIDARI，通过与一个在光调控过程中起作用的bHLH转录因子相互作用来抑制该转录因子活性，从而调控植物生长发育[12]. 　　随着水稻全基因组测序的完成，利用生物信息学分析发现，水稻中包含有167个bHLH转录因子，绝大多数成员功能未知.有研究表明，bHLH家族在水稻生长发育过程中起着关键作用，如Zhang[13]等发现一对参与BR下游的bHLH基因ILI1和PRE1可以通过形成异源二聚体的形式参与调控与BR相关的基因的表达.ili1的水稻突变体表现出与使用BR处理时相同的叶片倾角的表型，过表达和RNA干扰的ILI1转基因水稻株系都分别表现出了叶片倾角增加和减小的相反表型.ILI1和PRE1的相互作用导致了水稻叶片的直立.因此该家族蛋白功能的揭示将有助于丰富和完善水稻基因功能调控网络. 　　本研究选取了一个水稻非典型的bHLH基因家族成员Os11g39000 基因进行了初步的功能研究，发现转录因子Os11g39000可以以同源蛋白聚合体的形式结合DNA，从而实现生长素（IAA）信号转导，调节下游基因的表达，最终实现对水稻根部生长发育的调控. 　　1材料与方法 　　1.1生物信息学分析 　　利用TIGR（http：///tgi， Rice Genome Annotation Project）和NCBI（http：//， National Center for Biotechnology information）数据库获得Os11g39000全长CDS序列、氨基酸序列及启动子序列.通过基于隐马科夫模型的蛋白质结构域分析数据库SMART（http：//smart.emblheidelberg.de， Simple Modular Architecture Research Tool）对Os11g39000氨基酸序列比对分析，获得Os11g39000蛋白的结构域类型.同时，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对Os11g39000起始密码子ATG上游1 500 bp的启动子序列进行分析，预测该基因启动子区域所存在的调控元件，根据调控元件推测其可能的调控途径. 　　1.2载体构建与功能缺陷型转基因株系的获得 　　以粳稻品种日本晴的c