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川芎嗪对泡沫细胞胆固醇逆转运影响 　　[摘要] 目的：从胆固醇逆转运角度探讨川芎嗪对ox-LDL诱导泡沫细胞的干预作用。方法： 采用体外培养RAW264.7，以20 mg·L-1 ox-LDL诱导其转变成泡沫细胞模型，并用川芎嗪进行干预。通过油红O染色观察细胞内脂质堆积情况和酶比色法定量检测细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化，并用荧光定量PCR和免疫印迹方法检测PPARγ，LXRα，ABCA1 mRNA和蛋白表达。结果：川芎嗪能降低泡沫细胞内总胆固醇和胆固醇酯，抑制脂质积累，并提高PPARγ，LXRα，ABCA1 mRNA和蛋白的表达。结论：川芎嗪通过增加PPARγ，LXRα，ABCA1基因表达，促进胆固醇逆转运。 　　[关键词] 川芎嗪；泡沫细胞；PPARγ；LXRα；ABCA1 　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要原因和病理基础，表现为大动脉及中动脉的血管内壁出现脂质沉积，形成分散或成片的粥样斑块，造成动脉管腔狭窄， 随后斑块破裂出血，可在狭窄的动脉内形成血栓，导致缺血性脑卒中、心肌梗死发生。巨噬细胞泡沫化是早期动脉粥样硬化病变的标志之一，其形成主要原因是细胞内胆固醇平衡被打破，巨噬细胞大量摄取ox-LDL颗粒，在胞内大量蓄积胆固醇酯[1]，而PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路介导的胆固醇逆转运在维持巨噬细胞内胆固醇含量的动态平衡至关重要[2]。川芎嗪（ligustrazine）又名四甲基吡嗪（TMP），是中药川芎的主要药效成分之一。现代研究表明川芎嗪能通过抑制氧自由基的生成及增强氧自由基的清除，降低脂质过氧化反应，减缓动脉粥样硬化斑块形成，但其具体的机制尚未明确[3]。本研究拟从调节PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路角度探讨川芎嗪对泡沫细胞的影响，为川芎嗪抗AS作用机制的研究和临床应用提供实验依据。 　　1材料与方法 　　1.1细胞株与试剂 RAW264.7细胞株购于中国科学院上海细胞库；川芎嗪（纯度99%）购自安徽甙尔塔研究所；1640培养基、胰酶、新生小牛血清等购自杭州皓天生物技术有限公司；佛波酯（PMA）和油红O染料购自Sigma公司；荧光定量试剂盒购于TAKALA公司；PCR引物由上海生物工程公司合成； β-actin，PPARγ，LXRα，ABCA1抗体均购于Santa Cruz 公司。 　　1.2ox-LDL 制备 取300 mL健康人血浆，采用密度梯度离心法（1.019～1.063 g·mL-1）分离获得LDL，经凝胶过滤获得纯化LDL，LDL浓度定量后用PBS（pH 7.4）稀释至80 mg·L-1，加入1 mmol·L-1 CuSO4溶液使Cu2+ 终浓度为10 μmol·L-1，于37 ℃水浴氧化24 h。氧化后用含EDTA·2Na的PBS缓冲液透析24 h，终止氧化。ox-LDL经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL的氧化程度，最后Lowry法测定蛋白浓度，于4 ℃ 避光保存备用。 　　1.3川芎嗪对泡沫细胞增殖活力的影响 将RAW264.7细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃，5%CO2培养箱静置培养。加入含20 mg·L-1的ox-LDL及含3%胎牛血清的RPMI1640培养液共同孵育24 h。RAW264.7细胞诱导分化成泡沫细胞后，培养液中加入不同浓度川芎嗪（0，20，40，60，80，100，120，140 mg·L-1）干预24 h后，加入20 μL MTT 孵育4 h后，加入DMSO 150 μL震荡10 min，在波长570 nm处检测吸光度A570。 　　1.4细胞内胆固醇酯含量测定 1 200 r·min-1离心5 min，弃上清收集细胞，加入80 μL无水乙醇，超声10 s，工作10次，功率160 W，总胆固醇超声提取完毕后，1万r·min-1离心5 min，将上清液转移至新的EP管中，细胞内脂质含量按照脂质测定试剂盒说明书分别测定总胆固醇（TC）及游离胆固醇（FC）的含量，胆固醇酯（CE）含量即为TC和FC之差值。 　　1.5细胞内脂质测定 细胞接种于6孔培养板内，随机分为对照组（正常培养的RAW264.7细胞）、泡沫细胞组（20 mg·L-1的ox-LDL处理RAW264.7细胞24 h）、川芎嗪组（60 mg·L-1川芎嗪处理泡沫细胞24 h）。处理后，弃去6孔板中的上清液，用PBS轻轻洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS轻轻洗1次，然后 60%的异丙醇固定5 min，轻轻吸去异丙醇后加入0.5%油红O，在37 ℃染色20 min，去上清再用PBS清洗3次，置显微镜下观察并摄像。 　　1.6荧光定量PCR检测PPARγ， LXRα， ABCA1