屠宰废水中抗生素抗性基因在废水处理各工艺中去除与累积效果研究.docVIP

屠宰废水中抗生素抗性基因在废水处理各工艺中去除与累积效果研究 　　摘要：为探讨屠宰废水中抗生素抗性基因去除最佳处理工艺，采用荧光定量（PCR）技术检测屠宰废水处理工程各个环节中sul1、sul2、tetA、tetB和tetC等5种抗生素抗性基因绝对含量和相对丰度。结果表明，厌氧处理工艺和氧化塘工艺可以通过减少微生物生物量降低抗生素抗性基因的绝对含量，但也可以导致部分抗生素抗性基因相对丰度上升，而表面流人工湿地对于屠宰废水中抗生素抗性基因有有效的处理效果。 　　关键词：屠宰废水；抗生素抗性基因；PCR；表面流人工湿地 　　中图分类号： X703文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0292-04 　　收稿日期：2016-07-13 　　本研究以2种磺胺类抗性基因（sul1、sul2）和3种四环素类抗性基因（tetA、tetB和tetC）为研究对象，研究了其在屠宰废水处理工程中各个环节的绝对含量和相对丰度变化情况，以期寻找到最佳的抗生素抗性基因处理工艺，为相关企事业单位优化设计污水处理工艺提供理论依据，为浙江省“五水共治”提供技术支持。 　　1材料与方法 　　1.1水样来源 　　水样样品来源于浙江中法农业科技发展有限公司屠宰废水处理工程，其工程按流程包括3 000 m3厌氧沼气池、3 600 m3 潜流人工湿地、3 600 m3氧化塘和18 hm2表面流人工湿地等4个主要处理环节。按照废水处理流程选取了屠宰废水原水（即厌氧沼气池入水，采样点编号W1）、厌氧沼气池出水（即潜流人工湿地入水，采样点编号W2）、潜流人工湿地出水（即氧化塘入水，采样点编号W3）、氧化塘出水（即表面流人工湿地入水，采样点编号W4）、表面流人工湿地出水（即工程最终出水，采样点编号W5）等5个采样点，样品常温采集，保存于4 ℃环境，采样时间为2014年6月至2016年5月，每月下旬采样1次。 　　1.2实验试剂 　　TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffe、MgCl2、dNTP、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE、土壤基因组DNA快速抽提试剂盒、溴化乙锭、柱式DNA胶回收试剂盒、一步法快速感受态细胞制备试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，以上均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。pMD 18-T Vector，购于宝生物工程（大连）有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，序列[1]为：sul1-F：CACCGGAAACATCGCTGCA，sul1-R：AAGTTCCGCCGCAA GGCT，sul2-F：CTCCGATGGAGGCCGGTAT，sul2-R：GGGA ATGCCATCTGCCTTGA，tetA-F：GCTACATCCTGCTTGCCTTC，tetA-R：CATAGATCGCCGTGAAGAGG，tetB-F：CGAAGTAGG 　　GGTTGAGACGC，tetB-R：AGACCAAGACCCGCTAATGAA，tetC-F：TGCGTTGATGCAATTTCTATGC，tetC-R：GGAATGGT 　　GCATGCAAGGAG，16S rRNA-338F：ACTCCTACGGGAGGCA 　　GCAG，16S rRNA-518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。 　　1.3试验仪器 　　洁净工作台、稳压稳流电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、微型电泳槽、PCR反应扩增仪、紫外分光光度计、微量移液器、3730XL测序仪、LightCycler480 Software Setup。 　　1.4试验方法 　　1.4.1DNA抽提依照土壤基因组DNA快速抽提试剂盒说明书操作。 　　1.4.2标准品制备 　　1.4.2.1普通PCRPCR反应体系25 μL：模板DNA 0.5 μL，引物F（10 μmol/L）0.5 μL，引物R（10 μmol/L）0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer（10×）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，H2O 18.3 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，修复延伸72 ℃ 8 min，循环数35。 　　1.4.2.2PCR电泳2%琼脂糖凝胶，1×TAE，150 V，100 mA，20 min电泳观察（图1）。 　　1.4.2.3PCR回收依照柱式DNA胶回收试剂盒说明操作。 　　1.4.2.4克隆测序连接反应10 μL：Solution 5 μL，pMD 18-T Vector 10 ng