柑橘CitSERK―LIKE基因原核表达载体构建与表达.docVIP

柑橘CitSERK―LIKE基因原核表达载体构建与表达 　　摘要：用RT-PCR扩增伏令夏橙体细胞胚发生类受体蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）基因ORF区全长，克隆入载体，酶切后亚克隆入原核表达载体，并用SDS观察CitSERK-LIKE基因的原核表达情况。结果显示，成功构建了pET-CitSERK1-like原核表达重组质粒，该重组质粒在大肠杆菌中可经IPTG诱导表达分子量约为69 ku的融合蛋白，与预测蛋白一致。 　　关键词：柑橘；CitSERK1-like；表达载体；构建；原核表达 　　中图分类号： S188；S666.01 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0022-03 　　植物体细胞胚胎发生作为植物细胞全能性的一种表达方式，是高等植物合子胚发育早期事件中基因表达调控研究的理想模型[1]。体细胞胚发生类受体蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase）是在体细胞胚发生过程中发挥重要作用的一类激酶，属于LRR-RLK亚家族。Schmidt等首先从胡萝卜悬浮培养的胚性细胞中分离出第1个SERK基因，并发现它只在胚性细胞内表达且只表达到体细胞胚的球形期[2]。在其他物种中，体细胞胚发生过程与SERK基因紧密地联系在一起，相继在多个物种中克隆并鉴定了SERK基因，如鸭茅[3]、苜蓿[4-5]、水稻[6]、小麦[7]、马铃薯[8]、柑橘[9-10]、仙客来[11]、菠萝[12-13]等。 　　本研究在前期克隆获得柑橘体细胞胚发生类受体蛋白激酶基因CitSERK1-like的基础上[10]，构建了CitSERK1-like的原核表达载体，为今后大量表达、纯化CitSERK1-like蛋白和开展相关的功能研究奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 pMD-CitSERK1-like克隆载体的获得 　　根据GenBank登录的CitSERK-like基因序列 （登录号为FJ851422），设计正反向引物，FP：5′-ATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′；RP：5′-TCACCTTGGACCAGATAACTC-3′。PCR 反应在 PTC-200 Thermocycler 中进行。20 μL反应体系为：0.2 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1 U Ex Taq DNA 聚合酶 （TaKaRa，Japan） ，1×buffer，正反向引物各 0.4 μmol/L，50ng模板cDNA。扩增程序为：94℃变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶上分离后，用E.Z.N.ADNA 回收试剂盒 （Omega，USA） 回收备用。载体的连接参照TaKaRa公司的pMD18-T Vector试剂盒说明书进行，经PCR检测、测序验证pMD-CitSERK1-like重组质粒构建成功。 　　1.2 pET-CitSERK-like原核表达载体的构建 　　构建CitSERK1-like原核表达载体引物序列为：YHF：5′-CGGAATTCATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′ （EcoRⅠ），YHR：5′-GCCTCGAGTCACCTTGGACCAGATAAC-3′ （XhoⅠ），以稀释的质粒pMD-CitSERK1-like为模板进行PCR扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物电泳检测回收、测序，用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切质粒，回收酶切片段，与经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切的pET-28a （+） 载体进行连接，获得重组质粒pET-CitSERK1-like，构建流程参见图1。经PCR检测、酶切、测序验证ORF正确后用于蛋白表达。 　　1.3 pET-CitSERK-like原核表达载体的诱导表达 　　将重组质粒pET-CitSERK1-like和空白载体pET-28a （+） 分别转化表达菌株E. coli BL21，挑取阳性克隆，接种于3 mL LB液体培养基 （含卡那霉素），37 ℃振荡培养过夜，按1 ∶100的比例接种于新鲜LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养至D600 nm约为0.6～1.0时，加IPTG 1.0 mmol/L分别诱导0、1、2、3、4、5、6、7 h。其间收集菌液，4 ℃、12 000 g离心1 min，弃上清液，沉淀用100 μL SDS凝胶加样缓冲液 （T