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果梅品种荧光AFLP指纹分析 　　摘要：荧光AFLP以其操作简易、灵敏性高、可半自动化操作、可软件辅助分析等特点在果树品种鉴定以及遗传资源分析中具有明显的优越性。对荧光AFLP用于果梅品种鉴定进行了研究。所利用的8对选择性引物都可以获得清晰的AFLP指纹，并且任何一对引物都能够很好的区分这50个品种，表明了该技术适于快速鉴定大量果梅品种或用于种质资源的遗传分析。同时，研究利用AFLP指纹信息对来源我国江苏、浙江、广东、福建、云南、四川、湖南7个省份以及日本的果梅品种的遗传多样性指数进行了分析，结果表明，日本(O.245 1)，中国江苏、浙江(O.191 2)果梅的遗传多样性水平明显高于其他几个省份，可能由于这2个地区果梅品种的来源渠道多或者存在其他物种的基因渗入。 　　关键词：果梅；荧光AFLP；遗传变异 　　中图分类号：S662.4　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2009)04-475-06 　　 　　DNA是生命体的遗传物质，任何性状的形成根本上都是基因控制的。具体地说，基因的表达、表达产物蛋白的有无以及性状的类型等都是遗传物质DNA决定的。这也决定了DNA信息用于果树分类的优势所在。DNA分子标记的发展为果树分类提供了重要的技术体系。常用的DNA标记技术有RAPD(Rapid Amplified Polymorphic DNA)，RFLP(Re-stricted Fragment Length of Polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeats)、AFLP (Amplified Frag-ment Length P0lymorphism)以及SNPs (Sinde Nu-cleotide P0lymorphism)。这些技术各有优势，对于果梅品种分类都具有很好的适用性。Shimada等与Ozaki等先后利用RAPD技术对果梅进行了品种鉴定和分类，结果发现梅品种基因组DNA表现出丰富的多态性，而且某些品种有稳定遗传的特异带。张俊卫等对梅、桃、李、杏、樱桃进行了RAPD分析表明RAPD在鉴定物种及物种间亲缘关系中的具有很好的可行性。Gao等利用SSR标记进行果梅品种鉴别的研究。Fang等成功尝试了AFLP技术用于果梅品种鉴定的研究。其中，AFLP在技术稳定性、不需预知DNA序列信息、检测信息无限、易操作、可检测品种数量多等方面的特点使其在果树大量品种鉴别以及遗传资源分析方面具有更明显的优势。迄今，AFLP技术中指纹的显示主要采用银染、同位素标记以及荧光标记等，而后者在操作简易、高灵敏性、实验条件稳定、可半自动化、可仪器辅助指纹分析等方面的特点是很多DNA标记技术无法实现的。 　　梅(Prunus mume Sieb.et Zucc)在我国已有超过7 000 a的应用历史，其中果梅是我国特色果树之一。我国果梅种质资源丰富，仅记载的就有190多个品种与优株(不包括国外引进品种)，另外还有大量的野生果梅资源。开展DNA分子标记在果梅上的研究对于果梅品种鉴定、品种系谱分析、遗传图谱构建以及重要园艺性状标记具有重要的意义。为此，我们首先开展了果梅荧光AFLP指纹的研究，为果梅遗传资源的大量研究、基因标记研究、遗传图谱构建等提供了新的技术体系与研究经验。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　植物材料 　　50个果梅品种幼叶取自南京农业大学果梅种质资源圃(表1)。其品种信息可参考中国果树志一果梅卷，原产地分别为中国的江苏、浙江、广东、福建、云南、四川和湖南以及日本。 　　 　　1.2　DNA提取 　　基因组DNA的提取方法为改良CTAB法。 　　 　　1.3　荧光AFLP分析 　　本研究所采用的技术路线参考Fang等所介绍。DNA使用Hoefer DyNA Quant 200荧光计进行定量化后，利用Gibco-BRL公司生产的AFLP试剂盒(AFLP Analysis System I)进行AFLP分析。 　　提取后的DNA(150μg)利用1μL的EcoR I/Mse I酶(1.25 μnits?μL-1)在37℃条件下酶切6 h，然后使用1.5 μL(1 μnits?μL-1)的T4 DNA连接酶连接EcoRIIMse I接头(表2)，25℃条件下连接3h。酶切一连接后的DNA产物用ddH2O进行稀释10倍。 　　 　　 　　 　　PCR预扩增反应(所用引物序列见表2)在42μL反应体系中进行，稀释的酶切一连接DNA产物5.0μL，Pre-amp mix I 28.3 μL，10xPCR btxffer 4.2 μL，MgCl2(2.5 mmol?L-1)4.2 μL和Taq DNA polymerase(5μnits?μL-1