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玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体构建 　　摘要：蔗糖转运蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）是蔗糖装载、卸载、分配的重要载体，ZmSUT4是玉米低亲和、高转运能力SUT4亚族的唯一成员。以黄早四ZmSUT4全长cDNA序列为模板，设计带有限制性内切酶位点的特异性引物，PCR扩增获得正向、反向2个片段，将反向、正向片段双酶切后依次插入pGreen-HY104植物表达载体中，从而构建由35S启动子调控的ZmSUT4基因RNA干扰（RNAi）的植物表达载体HY104-A-S，然后通过冻融法将载体质粒转入含有pSoup质粒的农杆菌EHA105中。ZmSUT4基因RNAi的植物表达载体的构建为研究ZmSUT4基因的功能奠定了基础。 　　关键词：玉米；ZmSUT4基因；RNAi植物表达；载体构建 　　中图分类号：S513.03；Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0042-03 　　玉米的籽粒产量主要取决于籽粒形成过程中成熟叶片（源）光合产物的生产、韧皮部的运输（流）以及在籽粒（库）中的积累。光合产物的分配运输是植物体内源、流、库相互协调的结果，源足、库大、流畅是高产的基础[1-2]。目前对源、库的特性研究较多，但是由于受研究方法和条件等限制，如对DNA序列了解的限制，对流的了解还相当不足。研究发现，随着种植密度增加，收获指数快速下降，表明在较高密度条件下，流对产量的限制作用在增加[3]。流包括韧皮部的装载、筛管中运输、韧皮部卸出和同化物的重新吸收。蔗糖作为高等植物光合同化物运输的主要形式，也是联系源库之间主要的糖类[4]。细胞膜上的蔗糖转运蛋白（sucrose transporters，SUCs或SUTs）承担着蔗糖从源细胞的外运、韧皮部的装载和卸载，以及向库细胞的装入功能，从而影响蔗糖的运输方向、速率和分配，其基因表达受多种环境因子的调控。ZmSUT4是玉米体内唯一的高蔗糖转运能力SUT4亚族成员，在植物体内的蔗糖运输和分配过程中发挥着不可替代的重要作用。但是，关于玉米SUT4的研究才刚刚起步，李志鹏仅利用逆转录PCR（RT-PCR）技术检测ZmSUT4在玉米籽粒灌浆期花柄、籽粒等库器官的表达情况，未构建RNA干扰载体，分析ZmSUT4表达被抑制对植株生长发育及相关基因表达的影响[5]。本研究利用ZmSUT4基因的全长cDNA序列，构建ZmSUT4基因RNA干扰载体，为进一步研究ZmSUT4基因的生理效应及作用机制奠定基础，也为研究其他SUTs基因的功能提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　所用玉米材料为玉米优良自交系黄早四。 　　KAPA Hifi高保真DNA聚合酶，购自美国KAPA Biosystems公司；T4-DNA连接酶、限制性内切酶，购自NEB公司；植物总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit（cDNA第1链合成试剂盒）、质粒小提试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京TIANGEN公司；pEASY-T、大肠杆菌DH5α，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA marker DL2000，购自TaKaRa公司。引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成。Taq酶、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）等试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。植物表达载体pGreen-HY104质粒及含有pSoup质粒的农杆菌EHA105，均由国家玉米改良中心徐明良实验室提供。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 玉米ZmSUT4基因cDNA序列的获得 利用植物总RNA提取试剂盒提取黄早四幼苗总RNA，利用反转录试剂盒获得黄早四全长cDNA序列。 　　1.2.2 干扰片段的选择及引物设计 根据NCBI（http：///）上已发表的玉米ZmSUT4基因的全长cDNA序列，选择该序列上的特异片段及表达载体pGreen-HY104的限制性内切酶酶切位点，并设计引物。分别在5′端加上PstⅠ-EcoRⅠ、BamHⅠ-XhoⅠ酶切位点，引物序列为：F：5′-GCTGCAGAATTCGTCTGGAAACTCTTTGTGGGT-3′；R：5′-CGGATCCTCGAGCTCCTGTAACTTTTATTCATTGCT-3′。预期扩增片段长度为219 bp。 　　1.2.3 干扰片段的扩增 以全长cDNA序列为模板进行PCR扩增。反应条件为：热启动；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，无非特异性条带，则直接进行后续试验。 　　1.2.4 RNA干扰（RNAi）植物表达载体的构建 将PCR产物