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番木瓜四倍体诱导及形态学分析 　　摘　要：在离体培养条件下，将二倍体穗中红番木瓜无菌试管苗茎尖浸入0.05％、0.1％、0.2％、0.4％秋水仙素水溶液中处理1、2、3、4、5 d，诱导多倍体，对照用无菌水处理2d。结果表明0.2％的秋水仙素溶液浸泡处理3 d效果最好。诱导率为36.7％。通过体细胞染色体数目检测，变异芽为四倍体或嵌合体，四倍体染色体数目为36(2n=4x=36)。对获得的四倍体和二倍体进行了形态及气孔特征的比较，结果表明四倍体与二倍体植株在叶长、叶宽、叶厚、气孔大小、气孔密度、气孔保卫细胞大小及叶绿体数目等方面存在明显的差异，其中叶片厚度、气孔密度和保卫细胞内叶绿体数目可作为鉴别四倍体与二倍体的重要性状。 　　关键词：番木瓜；多倍体；性状 　　中图分类号：s667.97 文献标识码：A 文章编号：1009-9980(2008)01-115-04 　　 　　 　　 　　番木瓜(Carica papaya L.)又名万寿果、木瓜、乳瓜，是番木瓜科fCaricaceae)多年生大型草本植物。自上世纪70年代以来。国内外番木瓜的研究工作大多集中在栽培和加工等方面，而育种领域的研究相对较少[1-6]。而且在育种领域的研究中，人们多采用杂交育种和转基因等方法，以期达到改善果实风味，提高抗寒性、抗病性，使株型矮化、果实小型化以及延长货架寿命等目的。番木瓜株性高度杂合、雌雄异株、对病毒敏感是制约番木瓜遗传改良的3大客观因素[7]特别是番木瓜的杂合特性给大面积生产和杂交育种过程中的后代选择及性状稳定带来巨大的困难。使得以上除了株型矮化、果实小型化以外的育种目标均没有获得满意的突破以外，在无子番木瓜新品种的选育上更是一片空白。 　　关于番木瓜的离体培养方面，已有茎尖(茎段)、叶片、花药、体细胞胚培养、原生质体培养等的成功报道[1-6]。尚未见有番木瓜多倍体研究的报道。而且，随着木瓜蛋白酶需求量的不断增加，种植番木瓜基地的扩大，大量采乳后的番木瓜成为理想的营养保健食品的原料：但是。在这些食品的制作工艺流程中，除去种子是一个重要环节。若能培育出无子番木瓜，不仅可简化工艺流程，大大节约生产成本，还可使其品质得到质的提高。我们结合组织培养及秋水仙素诱导技术进行多倍体的诱导。以期获得稳定的四倍体株系，为进行四倍体与二倍体的杂交获得三倍体无子番木瓜奠定了基础，对于丰富番木瓜种质资源和培育新品种具有重要价值。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　 　　 　　1.1　材料 　　以穗中红番木瓜无菌试管苗为试验材料。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1 四倍体的诱导 将无菌试管苗茎尖浸入0.05％、0.1％、0.2％、0.4％秋水仙素水溶液中均处理1、2、3、4、5 d，对照采用无菌水浸泡2 d，然后转入MS+0.5mg/L 6-BA+0.05metENAA+30g/LSugar+6.5g/L Agar中培养，促使其丛生芽分化。 　　1.2.2　倍性鉴定采用改良去壁低渗――火焰干燥法[8]制片，镜检观察染色体数目确定植株倍性。 　　1.2.3　四倍体与二倍体植株形态与气孔特征比较选取相同生长阶段和环境条件下的纯合四倍体和二倍体植株相同数量的叶片，用直尺测叶长、叶宽、游时间的最佳组合研究中，以0.2％秋水仙素溶液处理3 d效果好，诱导率最高(36.7％)，且纯合四倍体植株的比例最大(6:5)。四倍体植株形态特征表现为叶片增厚、叶色浓绿、植株矮壮等，经体细胞染色体制片检测，染色体数目为2n=4x=36(图1)。将四倍体幼标卡尺测叶厚。取相同标准的10株植株进行测定，10计算其平均值。组培条件下，观察比较四倍体和二倍体试管苗在相同培养条件下生长状况等特征的差异。 　　气孔特征观察流程：取新鲜叶片一固定液固定1周左右→去离子水清洗几次→0,1％12-KI溶液染色10～20 min→镜检计数。在目镜带测微尺的普通显微镜下取3个视野测气孔长度和宽度、保卫细胞长度和宽度。取相同标准的样品10株，每个样品测定3枚叶片，每叶重复观测3次，计算各指标平均值，并统计气孔密度。利用Olympus显微镜镜检摄像。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　 　　2.1　四倍体的诱导 　　浸泡处理是秋水仙素对外植体作用最为直接的一种。结果表明，无菌苗浸泡在不同浓度的秋水仙素溶液中处理均能产生一定比例的变异，同时，材料的生长和分化也都在不同程度上受到抑制，甚至部分死亡(表1)。 　　从表1中看出在对秋水仙素处理浓度和处理苗茎尖转入增殖培养基中，均能分化出大量四倍体无菌苗。 　　 　　2.2　四倍体与二倍体植株形态特征比较 　　结果表明，四倍体与二倍体在植株形态上表现出明显的差异性。二倍体植株的叶片较薄、叶柄较细；四倍