番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因克隆及序列分析.docVIP

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因克隆及序列分析 　　摘　要：番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物，可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000―2001年，我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的eDNA片断并将其克隆到pMDl8-T载体上。序列测定结果表明，Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成，编码711个氨基酸；Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79％～84％，氨基酸序列同源性为89％～94％。聚类分析结果显示，葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远，Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。 　　关键词：番茄环斑病毒；复制酶基因；克隆；序列分析 　　中图分类号：S641.2　文献标识码：A　文章编号：1009－9980(2007)01－76－04 　　 　　番茄环斑病毒(romato ringspot virus，ToRSV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)L1l成员，主要分布于北美温带地区，可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃、大豆、菜豆、烟草、番茄等105个属、157种以上单、双子叶植物12)，侵染后引起植株黄化、斑驳、环斑、矮化、小果、易碎果。1975年，ToRSV侵染加拿大安大略地区的葡萄，产量损失76％～95％。同年，纽约地区的葡萄受TORSV侵染后严重减产，奥尔良悬钩子受ToRSV侵染后果实减产21％～50％。ToRSV有多种传播方式，介体剑线虫(Xiphinema sPP.)和嫁接是它田间传播的主要方式，而远距离传播主要靠种子和苗木等繁殖材料的调运。经种子传毒的植物较多，有桃、李、杏、草莓、苹果、烟草、番茄、菜豆、大豆等。 　　ToRSV是一种高风险的检疫性病毒，现列为我国对外检疫一类有害生物。2000―2001年我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。加强对外果树苗木接穗是否存在该病毒的检测就显得尤为重要。目前在我国还没有发生该病毒的报道。 　　为加强预警，防止危害性生物的入侵，本研究以ToRSV悬钩子分离物为材料，应用反转录PCR(RT-PCR)扩增基因组RNAl中的复制酶基因并进行序列分析，为建立该病毒的分子检测技术奠定基础。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　毒原：ToRSV悬钩子分离物(ToRSV-Ra)引自加拿大，接种番杏发病后作为本研究试材。 　　 　　1．2　生化及分子生物学试剂 　　SuperScriptTM Ⅱ RNase H-Reverse Transcriptase和7rizoL购自Invitrogen公司；Laq、dNTPs、pMDl8-T载体、DNA胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司：宿主菌株Escherichia coli DH 5α购白天为时代公司；其他生化试剂为常规分析纯试剂。 　　 　　1．3　引物设计与合成 　　根据GenBank数据库中ToRSV基因组RNAl序列，并参阅赵文军等报道的序列设计2对引物(表1)，由上海生工生物有限公司合成。 　　 　　1．4　病毒RNA的提取 　　称取感病番茄叶片0.5g加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管中，加入1mL的TrizoL试剂，剧烈震荡摇匀3min；4℃ 12000g离心10min，取上清；加入饱和苯酚一氯仿一异戊醇(25:24:1)500μL，上下颠倒混匀；4℃ 12000g离心10min，取上清；重复饱和苯酚－氯仿－异戊醇抽提步骤1次；加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀；4℃12000g离心10min，弃上清；加75％的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500g离心2min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μL dH2O(DEPC处理)中，-20℃保存备用。 　　 　　1．5　cDNA的合成 　　在0.5mL反应管中，加入模板RNA 8μL，20μmol/L下游引物2μL，DDW 30μL，65℃水浴5min，室温下冷却10min，加入10mmol/L dNTPs2μL，10×StrataScript buffer 5μL，40U/μL RNaseBlock Ribonuclease Inhibitor 1μL，50U/μL StrataScriot reverse transcriptase 2μL，混匀后42℃水浴60min，95℃水浴5min，合成cDNA。