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番茄沉默转基因植株获得及功能初探 　　摘要：Aux/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）作为生长素早期响应因子，其蛋白产物能够特异性地结合生长素响应因子（auxin response factor，ARF），从而调控生长素响应基因的表达，在整个植物生长素信号转导过程中发挥着重要的作用，进而影响植物的生长发育。本研究通过构建沉默载体，在高效遗传转化体系下获得转基因植株，发现利用Gateway克隆技术将番茄生长素早期响应基因 Domain Ⅱ区部分序列连入具有正反2个attr区域并连接1个内含子的pB7GWIWG2（Ⅰ）载体，可在植株体内形成发卡结构导致植物基因沉默，成功构建基因沉默表达载体名为SlIAA RNAi；此外，抗生素喷施和PCR扩增以及实时定量检测进一步鉴定，共获得12棵 RNAi阳性植株。本研究结果将为进一步明确SlIAA的生物学功能和阐明生长素的作用机理提供参考。 　　关键词：番茄；生长素；；载体构建；基因表达 　　中图分类号： Q785；Q786文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）05-0029-04 　　生长素（IAA）在植物的生长和发育中起着重要的作用，它不仅可以作用于细胞膜引起细胞的快速反应，而且还能够在分子水平上特异性地调控基因表达[1-2]。Aux/IAA作为生长素信号反应中的关键调控因子，已经在拟南芥、番茄等模式植物中进行了广泛的研究[3]。Aux/IAA基因属于多基因家族，目前在拟南芥中已发现有29个Aux/IAA家族基因，水稻和玉米中均有31个成员，黄瓜中有28个，棉花上有10个，马铃薯中有27个，苹果中有40个，草莓、高粱和番茄中有26个Aux/IAA家族成员[4-10]。 　　通过对拟南芥功能获得性突变体的研究，发现多数都是由Aux/IAA蛋白Domain Ⅱ核心区（VGWPP）的某个氨基酸的改变引起的，如Aux/IAA基因的突变会引起生长素反应因子（ARF）功能的紊乱，使植株出现生长素相关的异常表型，对生长素敏感性出现升高或降低 　　目前有关番茄基因在生?L发育中的作用尚无详尽报道。本研究通过转基因手段获得 RNAi植株，在对呈现的表型进行分析的基础上，探讨调控植物生长发育的作用机制，这有利于深化对Aux/IAA功能的认识，进一步了解生长素及其信号转导的分子机制，指导我们在生产实践中利用生长素及转基因技术调节植株生长与发育、果实成熟及产量提升等[9]。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　试验在沈阳农业大学蔬菜实验基地进行，供试番茄品种为中蔬6号，由中国农业科学院提供。供试植物总DNA及RNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京天根生化科技有限公司；Prime STAR、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA marker及反转录药品等购自宝生物工程渊有限公司，其他常规药品为国产分析纯。pENTRTM/D-TO[JP2]PO Cloning Kit 和Gateway LR Clonase Enzyme Mix为 Invitrogen 公司产品。以除草剂bar基因为筛选标记的植物表达载体Pb7GWIWG2（I） （ http：//gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7GWIWG2%281%29/search/index/silencing/any）、[JP]大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌LBA4404为笔者所在实验室留存。 　　1.2方法 　　1.2.1SlIAA沉默载体的构建 　　根据已经获得的cDNA全长，按照RNAi原理，设计引物F：5′-CACCGGGAATGAACTGGAATCG-3′，R：5′-CCGCTTTAGAGGCCGTGG-3′。PCR扩增干扰片段并胶回收纯化；TOPO Cloning及热激法转化大肠杆菌；碱裂解法小量提取质粒DNA。 　　1.2.2番茄植株 RNAi的遗传转化 　　将构建好的质粒用电击法导入农杆菌LBA4404，用农杆菌介导遗传转化方法转化番茄，待转化植株根系达到5 cm 时，将其移栽盆钵。 　　1.2.3阳性植株的筛选 　　通过Blast搜索bar基因序列，设计引物。序列为F：5′-GATAATCATCGCAAGACC-3′；R：5′-TCGACCGTGTACGTCTC-3′。以未转化的中蔬6号植株的基因组DNA作为阴性对照，遗传转化 RNAi载体质粒作为阳性对照，扩增目的片段。PCR扩增程序参照bar基因引物及酶的扩增条件等来设定。 　　2结果与分析 　　2.1 RNAi表达载体PCR及酶切检测 　　将测序成功的克隆重新提取质粒，采用质粒PCR的方法检测终载体，挑去若干个单克隆，同时以空载体质粒作为对照