耐盐米曲霉育种及其在广式酱油酿造中应用.docVIP

耐盐米曲霉育种及其在广式酱油酿造中应用 　　摘 要：通过对耐盐米曲霉育种及其在广式?u油酿造中应用的研究，结果表明，沪酿3.042米曲霉菌株经复合诱变，中性蛋白酶活力基本稳定在7569U/g，约是出发菌株的1.9倍。突变菌株HN01传代15次，均未检出黄曲霉毒素，食品安全性能稳定。在制曲过程中，添加食盐诱导，提高了突变菌株的中性蛋白酶的耐盐性，经HN01菌种酿造出的天然油氨基酸态氮较对照样提高了8.6%。 　　关键词：广式酱油；酿造；耐盐米曲霉 　　中图分类号 TS264.21 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）11-0011-03 　　Abstract：Through the research on salt-tolerant Aspergillus oryzae breeding and its application in Cantonese-style soy sauce brewing， the complex mutation of Aspergillus oryzae 3.042 strain showed that the neutral protease activity was basically stable at 7569 U/g， about 1.9 times that of the original strain. The mutant strain HN01 was passaged 15 times and no aflatoxin was detected. The food safety performance was stable. In the process of koji-making， addition of salt induces the salt-tolerance of the neutral protease of the mutant strain to be improved. Therefore， the amino acid nitrogen of the natural oil brewed by the HN01 strain is increased by 8.6% compared with the control sample. 　　Key words：Cantonese-style soy sauce；Brewing；Salt-tolerant Aspregillus oryzae 　　1 引言 　　对于高盐稀态酱油发酵工艺，其生产过程可分为大曲阶段和酱醪阶段2个阶段。大曲阶段是米曲霉合成和分泌蛋白酶的时期，是决定酱油氨基态氮生成的前提。酱醪阶段是蛋白酶水解大豆蛋白生成氨基态氮的主要时期，是决定酱油品质的关键。温度和水分是大曲阶段的主要工艺参数，会显著影响米曲霉的生长和产酶。温度和盐度是酱醪阶段的最主要的工艺参数，不仅会影响蛋白酶的活性，还会影响其稳定性。研究米曲霉固态发酵过程中温度和水分对菌体的生长及酶合成的规律，可以提高大曲阶段蛋白酶的产量。研究蛋白酶在高盐环境下的反应动力学和失活动力学，可以为酱醪发酵工艺的优化及耐高盐蛋白酶添加策略提供理论依据，进一步提高酱油品质并缩短发酵周期。 　　2 材料与方法 　　2.1 试验主要材料 酿造酱油生产原料：黄豆、面粉、麸皮，从市场采购。沪酿3.042米曲霉菌种：由上海市酿造科学研究所提供。亚硝基胍、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙试剂：由广州化学试剂厂提供。 　　2.2 主要设备 超净工作台、NK式蒸煮锅、发酵池、培养箱、3m3发酵罐。 　　2.3 试验方法 　　2.3.1 亚硝基胍与紫外线复合诱变及菌株初筛 （1）单孢子悬液制备：取28℃培养3d的斜面菌种，用50mL无菌水洗下孢子，置于三角瓶28℃、300r/min振荡30min，使孢子分散，用滴管加半滴吐温80，调整密度至106个/mL。（2）亚硝基胍诱变：吸取1mL单孢子悬液加入1mL 0.4mg/mL亚硝基胍溶液，使其终质量浓度为0.2mg/mL。28℃振荡反应30min。诱变结束后加入10mL、pH8.0磷酸缓冲液，4500r/min离心10min终止反应。（3）紫外线诱变：将上一步诱变完毕的孢子在紫外灯下30cm处照射处理20min。诱变结束后加入10mL、pH8.0磷酸缓冲液，4500r/min离心10min终止反应。（4）初筛：适当稀释诱变液，取适当稀释液涂布于耐盐性中性蛋白酶初筛培养基，28℃培养72h后计算致死率，并用透明圈法筛选蛋白酶酶解圈增大最大的菌株。耐盐性中性蛋白酶初筛培养基配方：脱脂奶粉4g、磷酸二氢钾0.36g、磷酸氢二钠1.07g、氯化锌0.04g、氯化钙0.002g、硫酸镁0