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采用扩增核糖体DNA限制性分析 　　摘 要：采用ARDRA对双孢蘑菇［Agaricus bisporus（Large）Sing.］培养料后发酵过程中的细菌群落结构进行研究。细菌16S rDNA文库ARDRA分析结果表明，细菌群落在后发酵过程中发生了明显变化，4个时期文库的16S rDNA组成分别以各自独有酶切类型为主。ARDRA文库优势类群的序列分析结果显示，培养料中的细菌组成远多于传统分离方法所获得的类群：在“空气调节”时期培养料(C6)中发现了一些未曾报道的Bacilli门成员，如Trichococcus属、Planococcus属和Caryophanon属,以及γ-Proteobacteria亚纲；而在“后发酵”开始和结束的培养料(C1和C7)中分别检测到了Thermus thermophilus和α-Proteobacteria亚纲的细菌，这些是近年来利用分子生物学方法在高温堆肥中发现的新类群；同时，在整个“后发酵”过程中还发现了大量目前尚未获得培养的细菌类群。 　　关键词：双孢蘑菇；培养料后发酵；细菌16S rDNA；细菌群落结构；ARDRA 　　 　　扩增核糖体DNA限制性分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）是将PCR技术和RFLP技术相结合衍生的分子技术，应用于rDNA限制性片段长度多态性的分析，对微生物遗传多样性，尤其是微生物的分类具有重要意义。本文在有效提取后发酵培养料中微生物DNA、成功构建细菌16S rDNA文库［1］的基础上，运用ARDRA技术对双孢蘑菇［Agaricus bisporus（Large）Sing.］培养料后发酵4个代表时期的细菌群落结构进行研究。期望为今后利用现代分子生态学方法快速、准确地检测培养料发酵过程中的微生物群落组成提供基础，同时为建立培养料后发酵的定量判断指标提供参考。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 　　16S rDNA克隆文库构建 　　双孢蘑菇后发酵培养料样品C1、C3、C6和C7的采样时期分别为后发酵开始、巴氏消毒结束、空气调节第5天和后发酵结束。样品中微生物DNA的提取，PCR 扩增，产物回收、克隆和16S rDNA克隆文库构建及插入情况检测见参考文献［1］。 　　1.2 　　ARDRA 分析 　　质粒用标准方法提取［2］, 然后用引物RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)和M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG AC-3’)扩增其中的16S rDNA 插入片段, 所得PCR产物经浓缩后分别用Hha I和Afa I两种限制性内切酶(宝生物工程有限公司，大连)37 ℃消化2.5 h。酶切DNA 片段用2% 的琼脂糖凝胶电泳分离, 经溴化乙锭染色和VDS凝胶成像系统(Pharmacia,美国)照相后, 所得DNA带型图谱进行人工比较分析。 　　1.3 　　酶切图谱分析 　　酶切图谱分析所用指标有丰富度、香农威纳指数、辛普森多样性指数和均匀度，计算公式依次为：d=(S-1)/lnN （S：16S rDNA酶切产生的总类型数，N：总克隆数）、H= -ΣPilog??2Pi（Pi：第i种16S rDNA酶切类型出现的频率）、D=1-ΣPi2和E=H/Hmax（Hmax为最大多样性）。 　　何丽鸿，等：采用扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构（Ⅱ） 　　1.4 　　系统发育分析 　　委托上海博亚生物技术有限公司对各文库中丰度较高(包含克隆数≥5)的酶切类型进行16S rDNA部分序列测定，测序结果在GenBank数据库中进行BLAST比对，检索相近序列。应用ClustalX软件计算本试验获得序列及数据库中相近序列的亲缘关系，并用Mega2 软件构建系统发育树。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1 　　16S rDNA的限制性酶切结果 　　4份培养料样品16S rDNA的PCR扩增产物均约为1.5 kb， 4个文库的目的片段插入效率均在90%以上［1］。扩增产物分别以限制性内切酶AfaI和HhaI进行酶切，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，部分电泳结果见图1和图2。 　　 　　如图所示，限制性内切酶HhaI 和AfaI相结合对插入片段扩增产物进行酶切，能很好地反映细菌16S rDNA序列组成的遗传多样性。 　　2.2酶切类型统计结果 　　酶切结果统计过程中，4个文库挑取的总克隆数均为150个，去掉部分未切开和条带分辨不清的克隆，C1、C3、C6和C7文库中成功酶切检测的克隆数分别为97、95、95和91，共378个克隆获得理想A