铁皮石斛Ty1copia类反转录转座子反转录酶序列克隆与分析.docVIP

铁皮石斛Ty1copia类反转录转座子反转录酶序列克隆与分析 　　[摘要]该研究根据Ty1-copia类反转录转座子RT的通用引物，从铁皮石斛浙江临安（C15）和云南广南（A39）种质中扩增得到43条Ty1-copia类反转录转座子RT序列，这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为，序列长度变化范围 260～266 bp，终止密码子和移码突变，所有序列均富含碱基AT，一致性为 47.1%～97.7%。经plantCARE软件分析发现受低温、热、光、各种植物生长调节物质等不同胁迫条件作用的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件。翻译成氨基酸后，有10条序列出现1～4个不同程度的终止密码子突变，5条序列出现移码突变，保守序列“SLYGKQ”发生变异的有 39条序列。其氨基酸序列经过系统聚类后可分为6类；且与其他植物（尤其是单子叶植物的小麦、荸荠）具有较高的同源性，表明它们间可能存在着Ty1-copia 反转录转座子的横向传递。 　　[关键词]铁皮石斛；Ty1-copia类反转录转座子；反转录酶（RT）；异质性 　　[收稿日期]2013-07-26 　　[基金项目]浙江省重大科技专项（2012C12912，2011C12002） 　　[通信作者]高燕会，副教授，主要从事植物生物技术和品种选育研究，E-mail：gaoyanhui408@126.com 　　[作者简介]李聪，硕士研究生，E-mail： lenilc@163.com 　　反转录转座子（retrotransposon或retroposon）指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件，包括长末端重复（long terminal repeat，LTR）反转录转座子和非长末端重复（non-long terminal repeat，non-LTR） 反转录转座子两类，而Ty1-copia类反转录转座子是LTR反转录转座子的一种，从单细胞的藻类到裸子植物和被子植物都存在[1-2]。转座子广泛分布于整个基因组，导致基因组多样性的原因主要有2个：转座作用，即由于反转录转座子在基因组中的复制与转座造成了基因组的多样性；反转录转座子之间或其LTR之间的同源重组[3] 。反转录转座子不仅在很大程度上影响着植物基因组多样性而且与植物进化有着密切的关系，有可能成为植物种属间进化、分化的证据[4]。例如，仅反转录转座子RIREI就造成了普通水稻Oryza sativa和澳洲野生稻O. australiensis基因组间差异的1/3[5]。玉米与高粱分化之后，玉米基因组内逆转座子的大量积累造成了两者基因组间的显著差异[6]。另外，LTR类反转录转座子的转录活性还受环境条件的调节，许多反转录转座子的转录可以被多种生物的和非生物的胁迫所激活[7]。因此，反转录转座子对基因组的类型、结构、表达、调控与进化方面都有重要的作用，近年来已成为研究生物多样性与系统进化、遗传连锁图谱建立、基因标签、基因功能分析、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具[8-9]。 　　铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是传统名贵珍稀中药材，被列为“中华九大仙草之首”，研究表明具有益胃生津、滋阴清热等独特功效[10]。在长期进化过程中，铁皮石斛种内和种间形成了丰富的遗传多样性[11-12]。为了探讨铁皮石斛基因组的遗传多样性和进化关系以及对逆境胁迫的反应机制，本研究以铁皮石斛浙江临安野生种质（C15）、云南广南（A39）为材料，克隆Ty1-copia类反转录转座子的RT基因片段并分析RT序列的异质性特点，试图为铁皮石斛的基因组进化和遗传多样性的研究提供依据，并为进一步研究反转录转座子在铁皮石斛对逆境反应机制的研究提供基础。 　　1材料 　　供试材料铁皮石斛C15具有较强的抗寒能力，原产于铁皮石斛分布的北缘浙江临安（119°12′E，30°31′N），A39抗寒较差，分布于铁皮石斛分布的南缘云南广南（04°31′E，23°29′N）。经浙江农林大学天然药物研发中心斯金平教授鉴定为铁皮石斛D. officinale，用其茎段在浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地组培室组织培养（生长期 240 d，光周期 16 h?d-1，温度 25 ℃）后供DNA提取。 　　DNA Ex Taq酶，MgCl2，10×buffer，dNTPs和克隆载体pMD18-T Vector均购自TaKaRa公司；克隆用大肠杆菌DH5α为本实验室保存；凝胶回收试剂盒购自XYGEN生物技术（杭州）有限公司；引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　2方法 　　2.1铁皮石斛DNA的提取 　　铁皮石斛基因组