铁皮石斛原胚体高效诱导增殖及多糖含量累积研究.docVIP

铁皮石斛原胚体高效诱导增殖及多糖含量累积研究 　　摘要：本实验以铁皮石斛愈伤组织为研究材料。具体研究了不同的基本培养基、蔗糖浓度、香蕉提取物浓度及NAA浓度的变化等对铁皮石斛原球茎增殖及多糖含量累积的影响。研究结果表明：适中的无机盐浓度，NAA、适量椰子汁的浓度都有利于铁皮石斛愈伤组织的增殖生长；无机盐、NAA浓度的变化对多糖含量的累积变化不大，而椰子汁的浓度变化对多糖含量的变化影响较大。 　　关键词：铁皮石斛；愈伤组织；原球茎；悬浮培养 　　中图分类号：S567.239 文献标识码：A 文章编号：1674—0432（2012）—08—0046—2 　　基金项目：贵州省科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队[2009]4007号）；贵州省青年教师基金，黔科合J字LKS[2010]16号 　　铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）珍稀濒危植物，传统名贵中药材，是石斛中的上品，具有抗衰老、抗肿瘤、滋阴清热、滋阴养胃、清热生津、润肺止咳之功效，扩张血管及抗血小板凝集等作用[3—5]。主要分布于我国云南、贵州、广西、台湾等地。铁皮石斛生长在年平均气温12℃～18℃、相对湿度60%～75%、林间透光度60%、无霜多雾、年降雨1100～1500mm的常绿阔叶林的树干上以及少数石灰岩上[1—2]。自然条件下，野生铁皮石斛种子通过风媒和虫媒传播，其成活率极低，从种子萌发到进入商品阶段要经过5～7年时间，生长缓慢，而且人们过度采挖，导致铁皮石斛资源日益枯竭[7]。铁皮石斛是珍稀名贵的中草药，由于市场需求过大，人们对野生石斛的过度采挖，致使我国的野生石斛资源遭到严重的破坏，野生石斛属植物资源已近濒危，为加强石斛的资源保护，建立无性系快速繁殖系统，提高培养材料的繁殖系数，实现大力发展药用石斛产业，从试管苗到大田栽培的中间环节成为制约铁皮石斛大面积人工栽培的主要障碍[8]，铁皮石斛已被列为濒危物种[4] 。为了缓解供求矛盾，研究者开始探索人工繁殖的方法。目前，铁皮石斛的繁殖方法大多为常规的固体培养[6]，有播种量小、周期长、劳动力消耗大、成本高等缺点，而液体悬浮培养可有效地解决这一问题，试验将对影响铁皮石斛种子液体培养的营养因子进行研究，以期为铁皮石斛的繁殖开发利用提供理论依据。本实验重点研究铁皮石斛原胚体高效诱导、增殖及多糖累积的影响，对于实现铁皮石斛的批量化生产具有一定的指导作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试材料为铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo），由贵州师范大学生命科学院生物化学与分子生物学重点实验室提供。 　　1.2 培养基及基本培养条件 　　试验采用的基本培养基为1/2MS固体培养基，蔗糖3%，pH5.8，培养条件：温度（25±2）℃，光照l2h/d，光照强度为120μmol·m—2·s—1 。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 原胚体诱导 　　将成熟未裂开的蒴果先用75%的酒精表面消毒30s，再用3%NaClO的消毒15min，无菌水冲洗5次。将蒴果切开，将种子接种于1/2MS的固体培养基中进行培养，在固体培养基中加入NAA0.3～0.5（mg/L 单位下同），培养40d后种子萌发为原胚体。 　　1.3.2 原胚体增殖试验 　　基本培养基为：以MS、1/2MS、B5、1/2B5、为基本培养基，均附加6—BA1.0+NAA0.2+3%（蔗糖）；蔗糖浓度为：以1/2MS+6—BA1.0+NAA0.2，分别附加0、1%、2%、3%的蔗糖；激素NAA浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+3%蔗糖，分别附加NAA 0、O.2、0.5、1.0；椰子汁浓度为：以1/2B5+6—BA1.0+NAA0.2+3%蔗糖，分别附加椰子汁0、10%、20%、30%。以上试验均重复3次，30d后统计数据。 　　1.3.3 可溶性多糖含量的测定 　　1.3.3.1 标准曲线的制作 配制100ug/mL蔗糖标准溶液，分别取0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL；加蒸馏水定容至lmL；测量620nm波长下的吸光度.以标准蔗糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=0.0048x+0.0065，R2=0.9926。 　　1.3.3.2 可溶性多糖的提取 将铁皮石斛原胚体于80℃烘干至恒重，称取0.2g，研磨。溶于20mL蒸馏水，煮沸20min，过滤。上清液加入2mL醋酸铅溶液去蛋白，再加入0.2g草酸钾沉淀多余的醋酸铅，再过滤，滤液定容至100mL，制得可溶性多糖提取液[9]。取lmL提取液，加入5mL蒽酮溶液，煮沸5min，迅速用冰水冷却，制得样品