一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立.PDFVIP

Med J Chin PLA, Vol. 41, No. 3, March 1, 2016 　189 论　著 一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt 1758- 1777 缺失突变 新方法的建立 粘学渊，许智慧，刘妍，李晓东，陈建宏，秦雅群，廖昊，徐东平 [摘要]　目的　建立一种新的单管巢式实时荧光P CR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV )样 本核心启动子区nt 1758- 1777 片段缺失突变。方法　通过比对分析GenBank 收录的HBV 基因序列，设计通用巢式P CR 引 物，建立优化方法体系；对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP 区进行扩增，产物直接测序，并随机选择50例样本进 行克隆测序，分析nt 1758- 1777缺失突变检出率。野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本，并对两种标准质 粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增，获得熔解曲线及熔解温度，得到熔解曲线的阳性标准。用新建立的方法对 34 0份样本进行检测，并用焦磷酸测序加以验证。结果　直接测序法检出16例(4 .7%) 阳性样本。标准质粒及克隆检测 ≥ ≥ ≥ 样本中缺失序列比例 15% 的样品，其熔解温度(Tm) 88.3 ℃，遂将 88.3 ℃作为新方法的阳性标准。用新方法检出 ≥ 4 7例(13 .8%) 阳性样本，其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例 1.0% 的样本38例， 1.0% 的样本9例；15份阴性样本缺 失突变比例均 1.0% 。用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0%作为阳性阈值，新方法对nt 1758- 1777缺失检测的阳性符合 率为80.9% ，阴性符合率为100% ，两种方法的一致性K app a值为0.67 1。结论　与直接测序法相比，新方法可显著提高 nt 1758- 1777缺失检出率，结合焦磷酸测序证实，可有效提高检测的准确性和经济性。该方法对建立HBV 其他缺失突变 的检测方法也可提供借鉴。 [关键词]　乙型肝炎病毒；核心启动子；基因缺失；熔解曲线；焦磷酸测序 [中图分类号]　R5 12.62　　　　[文献标志码]　A　　　　[文章编号]　0577-7402 (20 16)03-0 189-06 [D OI]　10. 11855/j.issn.0577-7402.20 16.03.04 A novel assay for detecting the mutation of nucleotide 1758-1777 deletion in core promoter region of hepatitis B virus 1 2 2 2 1 2 2 1* NIAN Xue-yuan , XU Zhi-hui , LIU Yan , LI Xiao-dong , CHEN Jian-hong , QIN Ya-qun , LIAO Hao , XU Dong-ping 1Institute of Infectious Diseases/Research Center for Clinical and Translational Medicine, 302 Teaching Hospital of Peking University, Beijing 100039, China 2Institute of Infectious Diseases/Research Center for Clinical and Translational Medicine, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China * Corresponding author, E-mail: xudongping302@