QINGEN质粒大提(自己翻译).docVIP

QIAGEN质粒大提 提取前准备： RNase A加入Buffer P1,终浓度100ug/ml,2-8℃ 检查Buffer P2中SDS状态（低温析出），必要的话37℃ 4℃ 准备材料: 标准的细菌培养物品（接种环、培养皿、摇床等）。 架子（垂直放置柱子。） 冰 70%酒精 异丙醇 质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5） 1.5-2.0ml离心管 4℃ 提取步骤： A)细菌培养、收获和裂解 1.新鲜培养板中挑取单克隆于2-5ml ALB培养基，37℃，300rpm培养8h。 2.按1/500-1/1000比例接种于ALB培养基，37℃，300rpm培养14-16h。高拷贝质粒：取100-200ul接种于100ml ALB培养基。低拷贝质粒：取250-500ul接种于500ml ALB培养基。（使用的培养器皿体积需大于四倍的培养基体积。培养的细菌密度达到3-4X10~9个/ml，这样得到的菌斑重量为3g/L培养基 3.将获得的菌液4℃，6000g离心15min。（如果此时你想停止提取，可将菌斑冻于- 4.加入10ml Buffer P1充分重悬菌斑。（确保使用的容器足够装下裂解液，确保使用前加入RNase A，如果Buffer P1内加入LyseBlue,使用前轻柔晃动瓶身以确保LyseBlue混匀，必须确保菌斑充分混匀） 5.加入10ml Buffer P2，轻柔颠倒4-6次混匀彻底，室温（15-25℃）孵育5min。（不能涡旋混匀，这样会使基因断裂。此时溶液变粘稠。不要使裂解反应过程超过5min。加入Buffer P2后立即扣上盖子，避免空气中的CO2使其酸化。如果Buffer P1内加入LyseBlue，那么加入Buffer P2后细菌悬液变蓝，如果悬液不变蓝或仍可见棕色斑块，则继续混匀直到显色 6.加入10ml Buffer P3，立刻轻柔颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20min。（使用预冷的Buffer P3和冰浴可以加快沉降，加入Buffer P3后可见白色絮状沉淀，沉淀中含有基因组DNA，蛋白质，细菌碎片和KDS。裂解液需彻底混匀以确保钾、硫酸盐沉淀。如果混合物依然有粘性，那么继续混匀彻底中和溶液。如果使用LyseBlue，蓝色溶液变清。） B)提取上清 7.以4℃，不低于20000g离心30min，立刻取含有质粒的上清。（离心前，需再次混匀样品。离心需要在非玻璃器皿中进行，例如聚丙烯。离心后上清液清透。 8.以4℃，不低于20000g离心15min再次离心，取上清。 C)用QIAGEN-tip连接、清洗和洗提质粒DNA 9.向QIAGEN-tip 500中加入10mlBuffer QBT平衡柱子，通过重力使其自然流空。（QIAGEN-tip需要彻底流干，此过程不需要看守，当液面达到柱子上部时自然会停止。） 10.将从第8步获取的上清移入柱子，使其自然流下通过滤膜。（上清应该立刻移入柱子。如果时间停滞过长或者因为蛋白的继续沉降使其浑浊，在放入柱子之前需要重新离心。）移取120ul滤液作为样品2. 11.用2X30ml Buffer QC冲洗柱子。（Buffer QC自然通过柱子，第一遍冲洗足以将绝大多数质粒污染物洗脱，但是当提取量大时，第二遍就非常重要。）移取240ul滤液作为样3。 12.用15ml Buffer QF洗脱DNA。（用15ml或50ml离心管收集洗脱液。不推荐使用聚碳酸酯离心管，因为不能耐受后续步骤使用的酒精。注：如果产物大于45-50Kb，65℃预热洗脱Buffer有助于提高产量。） D)沉淀、清洗、溶解DNA 13.加入10.5ml（0.7倍体积）室温异丙醇到洗脱液中沉淀DNA。立刻混匀，4℃，不低于15000g离心30min。小心弃上清。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5000g离心60min。异丙醇沉淀具有玻璃外观，比酒精沉淀的絮状含盐沉淀难发现 14.加入5ml室温70%酒精，不低于15000g离心10min。小心弃上清避免碰到沉淀。（一次性锥形底离心管可以选择4℃，5 15.空气中干燥沉淀5-10min,用合适体积的质粒溶解液（TE，PH8.0或Tris.Cl,PH8.5）溶解DNA。（溶解DNA时清洗侧壁，充分收集，特别是使用玻璃器皿时。应避免使用移液器反复吹打促进DNA混匀，这可能会导致DNA断裂。沉淀过于干燥会导致DNA难以溶解。DNA溶液最好保存在微碱性环境中，酸性Buffer难以溶解DNA。）