TNF―α―308与238位点基因多态性与梅毒发病关系研究.docVIP

TNF―α―308与238位点基因多态性与梅毒发病关系研究 　　【摘要】目的：探讨肿瘤坏死因子TNF-α-308、TNF-α-238位点基因多态性与梅毒发病的关系。方法：采用等位基因特异引物聚合酶链反应（AS-PCR）分析显性梅毒组（A组）共93例；潜伏梅毒组（B组） 共55例以及正常对照组（C组）41例 TNF-α-308、TNF-α-238位点基因多态性。结果：三组TNF-α-308位点等位基因、基因型频率比较，差异有统计学意义（P0.05）；TNF-α-238位点基因型频率比较，差异有统计学意义（P0.05）。结论：人梅毒患者中TNF-α-308 A和238A的存在过度表达，且TNF-α-308、238位点基因多态性与梅毒的发病及病程进展可能有关系。 　　【关键词】梅毒；肿瘤坏死因子-α；多态性；单核苷酸 　　【中图分类号】R759.1【文献标志码】A 　　机体感染了梅毒螺旋体后，其临床症状表现多样化、程度轻重不一；可以表现为显发梅毒，也可为潜伏梅毒；不同患者对治疗的反应性和敏感性不同，其临床疗效也相差甚远。这提示我们梅毒螺旋体本身可能存在基因与决定遗传易感性中起到关键作用＼[1，2＼]，可能与机体发生免疫应答的强度相关，可决定梅毒感染的发生、发展及转归等方面。 　　目前，国内外关于人类梅毒遗传易感性方面的研究尚未见深入报道。我们通过借鉴其他诸如乙型肝炎病毒、HIV及结核等感染性疾病的遗传易感性的研究，拟选用梅毒免疫发病中与抗原识别摄取相关的Thl反应性细胞因子TNF-α作为研究的目的基因，通过对其基因SNP位点的分析，探讨其与梅毒易感性的关系，为今后的临床诊治提供新的理论和实验基础。 　　1材料与方法 　　1.1病例分组 　　病例148例为我院确诊为早期梅毒（梅毒血清学检查RPR、TPPA阳性，病程2年）患者。其中男91例， 女57例； 平均年龄（31.5 ±6.4）岁； 有典型的临床症状及体征（出现硬下疮、扁平湿疵、掌拓红斑等皮疹）的患者为显性梅毒组（A组）共93例；未出现典型临床症状和体征的患者为潜伏梅毒组（B组） 共55例。正常对照均为同期健康献血者，经献血前常规体检排除乙肝、HIV感染（C组）。 　　1.2方法与步骤 　　1.2.1主要试剂和仪器96孔PCR仪（Roche公司，美国，型号LightCycler 96）；血液基因组提取纯化试剂盒（Promega，型号MD1360，美国）；凝胶成像系统（UVP，型号Biodoc-IT 220美国）。 　　1.2.2基因组DNA的提取和纯化采用含有乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K）的抗凝管抽取各组受测者的空腹外周静脉血3mL，应用基因组提取纯化试剂盒提取基因组DNA。采用12000r/min转速室温离心15min，提取血样的基因组DNA，并保存于-20℃冰箱以备检测使用。 　　1.2.3分析TNF-α-238和308位点的基因多态性于美国国立生物技术信息中心官方网站上查询并获得人类TNF-α基因的全序列，利用Primer 5.0软件设计各个序列引物，引物委托上海生工有限公司合成。采用聚合酶链反应一限制性片段长度。多态性（PCR-RFLP）分析，并完成扩增。TNF-α-308 G/A 扩增引物序列为：上游引物： 5- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3，下游引物序列：5 - TCCTCCCTGCTCCGATTCCG -3，产物大小156 bp；TNF-α-238 G/A扩增引物序列：上游引物：5-ATCTGGGGAACGGTAGTG-3 ，下游引物序列：5-AGAAGACCCCTCGGAACC-3，产物大小164 bp。 　　扩增反应体系总体积为25μL，包含有PCR Master Mix 12.5μL，cDNA模板2μL，上下游引物各1μL。扩增反应条件为：95°C预变性2 min，然后94°C变性1 min，64°C退火1min，72°C延伸1min；循环进行35次，末次再于72°C延伸5min，4°C冷却终止反应；产物取出后加入限制性内切酶MspI5U，于-20°C冰箱保存。采用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增的产物，并鉴定目的基因的等位基因及基因型，电脑软件凝胶成像进行分析图像。 　　1.3统计学分析 　　采用SPSS 19.0软件分析。两组资料比较：计量资料采用独立样本t检验或计数资料的χ2检验；多组计量资料比较采用方差分析，用Hard-Weinberg遗传平衡法分析检验样本的群体分布是否符合遗传规律。检验水准为a0.05。 　　2结果 　　2.1血清DNA片段琼脂电泳分离鉴定结果 　　电泳可见单一清晰条带，表明所提取的DNA无降解。见图1。 　　2.2TNF-α-238等位基因基因型的鉴定 　　PCR