动物细胞培养的应用课件.pptVIP

动物细胞培养的应用;表1 动物细胞培养的产物 ;表2 微生物和动物细胞培养方法的比较;5、动物细胞大规模培养工艺 ;图11-15 大规模动物细胞培养工艺流程图;抗体; 于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。;补充;细胞系 ;动物细胞制药的表达系统与特征 ? 昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。? 一、哺乳动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、 细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。;2．哺乳动物细胞株系 CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。 有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市。 使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。;BHK－21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达的重组凝血因子Ⅷ已被获准上市。 C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。 3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。 骨髓瘤细胞：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞，分泌IgA，用于转染研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。 ;杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。 Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。 COS：是从SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。 GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗的研究。 ;3．昆虫细胞株系 Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。 Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。 TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。 ;三、细胞转染 转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。;方法 ;化学转染是最常用的转染方法。 其基本原??是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）－葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。 磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE－葡聚糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。 渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。 影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。;方法 ;四、转染体筛选与分离 转染后1～6天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。 为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养24～48小时，让细胞倍增1～2代，使转染DNA表达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每2～4天更换培养基，持续2～3周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。 在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。 哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。 ;选择剂 ;报告基因