毕业论文设计《e建立快速准确检测L-谷氨酰胺的体系论文》.docVIP

PAGE 2 e建立快速准确检测L-谷氨酰胺的体系 福建师范大学生命科学学院 生物工程专业 【摘 要】 本文针对L-谷氨酰胺的特性，建立了一套快速准确检测L-谷氨酰胺的方法，包括纸层析法定性检测L-谷氨酰胺及高温高压酸解—酶膜联用法定量检测L-谷氨酰胺。在通过对薄层层析及纸层析的比较，选用纸层析作为定性检测L-谷氨酰胺的方法，并对不同展层剂的层析效果进行比较选出较优的展层剂配方（体积比）正丁醇︰乙酸︰水=4︰1︰2。对L-谷氨酰胺在酸性条件下水解的特性进行研究，确定了使用生物传感仪检测待测液在高温高压条件下酸水解前后的谷氨酸差量间接测量L-谷氨酰胺的含量，此方法的测量范围为0.15g/L-0.5g/L，在此范围内L-谷氨酰胺的分解率可达到100%，并利用HPLC对其进行验证。 【关键词】 L-谷氨酰胺；纸层析；谷氨酸；生物传感仪；高温高压酸解 L-谷氨酰胺（L-Glutamine，L-GLn）作为人体最重要的条件性必需氨基酸，结构式为NH2OC-CH2-CH2-CH(NH2)COOH，等电点为5.65，相对分子质量为146.15，是一种中性氨基酸[1-3,12]。目前，L-谷氨酰胺的工业化生产均采用微生物发酵法。主要生产国为日本和韩国，而在西方国家少有报道,发酵技术水平也是日韩两国领先，特别是日本[4-6,13,14]。近年来，我国对L-谷氨酰胺的发酵生产进行了一系列的研究[7,15] 并取得大量成果，L-谷氨酰胺的定量分析一直存在困难，受L-谷氨酰胺不稳定特性的影响，在检测时会有一部分损失，从而影响了检测结果的准确性。L-谷氨酰胺在很多条件下易分解，例如在酸、碱以及受热等条件下都容易发生分解，其水溶液在常温下长时间放置也会发生水解，并且很容易被微生物分解利用，因此L-谷氨酰胺的定量测定首先要克服的就是其不稳定性造成的影响。由于L-谷氨酰胺与谷氨酸结构相似又在差异，而在微生物发酵生产L-谷氨酰胺时其主要杂质为谷氨酸，所以在对L-谷氨酰胺进行定性检测时最重要也是最困难的就是将二者区分开来。 目前，发酵液中L-谷氨酰胺的定量分析通常采用2类方法：直接法和间接法，其中直接法包括纸层析法[8](或者薄层层析法)和高效液相色谱法；间接法除了可利用L-谷氨酰胺酶分解成谷氨酸：L-GLn+H20→L-Glu+NH3 间接测量L-谷氨酰胺，还可利用L-谷氨酰胺中的酰胺基团的水解特性：L-GLn + H20→L-Glu + NH3通过检测水解产物谷氨酸或者氨就可间接得到L-谷氨酰胺的浓度。以上各种方法在实际应用中都存在一些不足之处，无法做到简单易行和准确测量。近年来谷氨酸浓度的测量已经采用了简便而准确的生物传感仪，为L-谷氨酰胺的定量分析提供了新的思路。首先验证L-谷氨酰胺酸水解产生谷氨酸的特性，在水浴下L-谷氨酰胺的酸水解率仅有60%左右[9]，由于水解率的不确定性，在间接换算时存在一定的误差，故以酸水解为前提，确立了分析发酵液体中L-谷氨酰胺浓度的方法—— 高温高压酸解-酶膜联用法。此法耗时相对较短，检测效果更加精确，操作较简便。 分配层析是利用混合物中各组分在两种不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方法，纸层析则是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相，有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配，从而得到分离[8]。 纸层析经常被应用于各种氨基酸的定性检测，也有用于粗略的定量分析，在这里用于L-谷氨酰胺的定性检测[10,11]。在对各种展层剂的理化特性进行对比后选择常用的正丁醇、乙酸、水，因为相比其他展层剂这几种药品毒性相对较小，效果较好。由于比例不同效果也不同，因此需要对不同比例的展层剂配方进行研究对比，找到一个合适的比例，使谷氨酸和L-谷氨酰胺初步分离，将发酵液中的主要杂质谷氨酸与目标产物L-谷氨酰胺区分开来，达到快速检测发酵液中是否含有目标产物并根据斑点大小粗略判断发酵液中L-谷氨酰胺的含量。在经过大量实验对比最终选择正丁醇、乙酸、水的比例为4︰1︰2，其分离效果好，底色浅，扩散少。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 器材 立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）； SBA-40D型生物传感自动分析仪（山东省科学院生物研究所）； 高效液相色谱仪（安捷伦1100）； 20mL分液漏斗，培养皿，干燥缸，电吹风，喷雾器（装有0.5%茚三酮）,15cm×15cm方形滤纸，等。 1.1.2 药品 L-谷氨酰胺标准品购自国药集团化学试剂有限公司；硫酸、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾等均为国产分析纯；发酵培养基：葡萄糖 20g/L，玉米浆 30mL/L,K2HPO4 1 g/L,KH2PO4 0.5,MgSO4 0.4 g/