分析化学 第十章亲和色谱课件.ppt

（7）组氨酸 在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。 （8）肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低 活化 　　 基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。 溴化氰活化法 溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下： 介质活化与耦联 活化耦联过程 20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min 搅拌过程中加入溴化氰，4-5℃10min 过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤 加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4℃保存 这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。 环氧基活化法 在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物； 在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。 这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－C 和S－C 键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH 为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。 上面两种方法是比较常用的方法 。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。 亲和配基耦联密度测定 耦联密度决定了介质的吸附容量 分光光度法 量差法分析 水解作用分析 元素分析法 间臂分子 当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。 如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。 加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。 间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。 常见的亲和色谱 核苷酸及辅酶亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 染料亲和色谱 免疫亲和色谱 基团专一性大分子亲和色谱 核苷酸及辅酶亲和色谱 指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的 介质制备 碳二亚胺直接法偶联 溴化氢活化琼脂糖→连接氨基己酸→加入核苷酸→溶液 中保存→洗涤→偶联 间接偶联法 间臂分子和核苷酸→活化的介质 吸附和解吸 选择合适的缓冲液条件下吸附 一般采用辅酶或盐溶液进行梯度洗脱 固定化金属离子亲和色谱 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。 金属离子如锌和铜。 * 将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。 金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等 . 亲和作用机理 静电作用 配位键结合 共价键生产 π 键 吸附 采用50mmol/L的金属盐溶液通过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。 平衡缓冲溶液洗去未螯合的金属离子 加入适宜浓度的NaCl和选择合适pH值有利于减少非特异性吸附。 解吸 吸附蛋白质解吸