分子生物学检验技术第5章课件.ppt

2.RNA的保存 三、核酸的鉴定与保存 RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃ 保存 RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延长保存时间 用于配置试剂及溶解RNA的H2O均应经DEPC处理 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 生物体组织细胞 玻棒缠绕法 酚抽提法 基因组 DNA粗品 PFGE分离 特定的DNA片段 AGE分离 PAGE分离 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品 精分离 粗分离 前处理 离子交换层析纯化 有机溶剂抽提 细胞裂解蛋白质变性沉淀降解DNA释放 甲酰胺解聚法 哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 第二节 真核基因组DNA的分离纯化 一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收 一、酚抽提法 1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法 以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞 经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提，获得DNA粗制品 一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 1987年Kupiec等报道了甲酰胺解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提。 三、玻棒缠绕法 玻棒缠绕法是在Bowtell(1987)方法的基础上经改进而来 四、其它方法 有些分子诊断技术并不需要高分子量的DNA样品，因此步骤简化、操作简便的DNA快速提取法广泛使用。 1.异丙醇沉淀法 2.玻璃珠吸附法 五、 DNA片段的纯化 常用的纯化方法： 有机溶剂抽提法 柱层析法（column chromatography） 五、 DNA片段的纯化 六、 DNA片段的回收 原则与要求: 1.提高片段的回收率 2.清除回收的DNA样品中的杂质 六、 DNA片段的回收 （二） 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 （一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法 （一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 六、 DNA片段的回收 （二）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段 标准方法是压碎与浸泡法。费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。 六、 DNA片段的回收 第三节 质粒DNA的提取与纯化  第三节 质粒DNA的提取与纯化 二、煮沸裂解法 三、SDS裂解法 四、其他方法 一、碱裂解法 五、质粒DNA的纯化 一、碱裂解法 在强碱（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。 一、碱裂解法 细胞裂解后，细胞壁、细胞膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物 当pH调至中性，质粒DNA重新恢复天然的超螺旋结构 在高盐条件下沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中 一、碱裂解法 二、煮沸裂解法 将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，TritonX-100和溶菌酶能破坏细胞壁，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。 二、煮沸裂解法 质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构 通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA, 然后回收上清液中的质粒DNA 三、SDS裂解法 将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁 用SDS裂解去壁细胞，温和释放质粒到等渗液中 用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA 三、SDS裂解法 由于条件温和， SDS裂解法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但由于部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。 第五章 核酸的分离纯化 温州医学院 彭 颖 DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象 DNA和RNA的分离纯化是分子生物学研究及分子诊断最基础的工作 第五章 核酸的分离纯化 核酸分离纯化的原则: 保持核酸一级结构的完整性 尽可能提高核酸制品的纯度 第五章 核酸的分离纯化 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化 第五章 核酸的分离纯化 第一节 核酸分离纯化的设计及原则 一、材料与方法的选择 （一） 材料与方法的选择 （二） 选择原则 （一） 材料与方法的选择 不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、 产量及浓