DNA条形码形态学和地理分布相结合さ闹参锕实鉴定方法.docVIP

DNA条形码形态学和地理分布相结合さ闹参锕实鉴定方法 　　摘要：以单一方法鉴定物种具有参考文献（或比对数据）少、专业要求高的缺点。以新疆口岸进境货车截获的未知植物果实为例，从分子、形态、地理分布3个维度，对该未知果实逐级进行分类鉴定。根据ITS、atpF-H、psbK-I 3段植物DNA通用条形码序列，以及形态学和地理分布信息，最终确定该未知果实为原产于西亚的蔷薇科蔷薇属犬蔷薇（Rosa canina L.）。本方法简单、准确，弥补了现有单一检测鉴定技术的不足，适用于进境产品中植物果实或种子的检疫鉴定。 　　关键词：外来入侵植物；种子；果实；植物检疫；犬蔷薇；DNA条形码；种子形态学；地理分布 　　中图分类号：S41-3 文献标志码：A 文章编号：1003-935X（2015）02-0026-06 　　2013年，中国进出口贸易总值达4.16万亿美元，首次超过美国位列世界第一。与此同时，有害生物通过国际贸易传播的概率也大大增加。近几年，以边境口岸为主的有害生物截获事例不断增多，其中不乏危害国家经济生活安全的有害物种。如此之多的外来生物，亟需快速、准确的检测鉴定方法。植物检疫中外来有害植物的鉴定多以形态学为主。其中，有关制定与发布的国家标准12项、行业标准20项，方法基础与背景主要为形态学。此外，口岸截获的外来植物组织多为果实或种子，有关植物果实或种子的研究资料少，形态学特征数据不足。随着分子生物学技术的发展与完善，DNA条形码概念的被提出，检测鉴定方法也在不断更新。在科技部支撑计划项目“检疫性有害生物DNA条形码检测数据库建设及应用（编号：2012BAK11B00）”的支持下，分子检测鉴定技术在口岸外来有害生物识别工作中逐步开展。随着检测鉴定方法从形态到分子的不断完善，鉴定效率也得到提高。 　　新疆是古“丝绸之路”的重要通道，周边与哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦等8个国家接壤，是我国邻国最多、边界线最长的省（区）。新疆对外开放的一类口岸有17个，二类口岸有12个，以陆运（公路、铁路）口岸为主，往来车辆、人员复杂，外来有害生物传入风险高。本研究通过分子生物学、形态分类学和物种地理分布信息3个方面的研究，对截获于自喀什口岸入境车辆上的未知果实进行鉴定。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　未知植物果实来源于新疆喀什口岸进境货车车厢内清理出的废弃物。 　　1.2 分子生物学 　　试验选用ITS、psbK-I、atpF-H 3段DNA条形码序列用于分析研究，所用引物分别为ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），psbK（5′-TTAGCCTTTGTTTGGCAAG-3′）和psbI（5′-AGAGTTTGAGAGTAAGCAT-3′），atpF（5′-ACTCGCACACACTCCCTTTCC-3′）和atpH（5′-GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT-3′）。反应体系为：总反应体积25 μL，0.5 μg模板DNA，引物各10 pmol，100 μmol/L dNTP，2 mmol/L MgCl2，2 U Taq DNA聚合酶。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，47.0～51.3 ℃（ITS序列51.3 ℃、psbK-I序列47.0 ℃、atpF-H序列48.3 ℃）退火1 min，72 ℃延伸50 s，共37个循环；最后延伸72 ℃，10 min。 　　序列校正软件使用CondonCode Aligner与GeneStudio。所获得序列在GenBank中配对比较。系统发育关系分析软件使用MEGA 6.0，采用Neighbor-Joining算法中的Kimura 2-Parameter模型构建系统树，自展分析1 f000次。 　　1.3 形态学比对和地理分布信息收集 　　种子形态学比对信息来源于种质资源信息网（GRIN，germplasm resources information network，http：///）以及各国与国内地区植物志。地理分布信息来源于作物保护大全检索系统（CPC，crop protection compendium，http：///）、全球生物多样性信息网络（GBIF，global biodiversity information facility，http：///）以及各国与国内地区植物志。 　　2 结果与分析 　　2.1 DNA条形码比对结果 　　将试验所得样品ITS、psbK-I、atpF-H 3段基因序列在GenBank中配对比较，发现与蔷薇属（Rosa）相似度最高。通过psbK-I，发现未知物种（XJKS）与Rosa odor