大型艾美耳球虫18S rDNA部分序列测定和系统发育分析.docVIP

大型艾美耳球虫18S rDNA部分序列测定和系统发育分析 　　摘要：从河北某兔场分离大型艾美耳球虫卵囊，ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ。利用艾美耳属球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ保守引物，ＰＣＲ扩增大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，产物纯化后测序。将测得的序列用ＤNASｔａｒ软件分析并与ＧｅｎBａｎｋ中公布的１１种兔球虫的相应序列进行同源性比较，绘制系统进化树。结果表明，扩增出大小约为１ ５２２ ｂｐ的１８Ｓ ｒＤＮＡ片段，序列分析显示河北株大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ与ＧｅｎBａｎｋ 公布的大型艾美耳球虫１８Ｓ ｒＤＮＡ比对，同源性达９９．６％；与国外的１１种兔球虫相应序列同源性在９２．４％～９９．６％之间。 　　关键词：大型艾美耳球虫；１８Ｓ ｒＤＮＡ；测序；系统发育分析 　　中图分类号：Ｓ８５２．７２＋３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1838-04 　　 　　Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅimeria ｍａｇｎａ 　　 　　ＦＡＮＧ Ｓｕ－ｆａｎｇ，ＧＵ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＣＵＩ Ｐｉｎｇ 　　（Ｃｏｌｌｏｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｇjｉａｋｏｕ ０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，China） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｏｏｃｙｓｔ ｏｆ Ｅimeria ｍａｇｎａ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｒａｂｂｉｔ ｆａｒｍ ｉｎ Ｈｅｂｅｉ． Ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＡＴＢ． Ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ ＤNASｔａｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｐａｃｋａｇｅ ａｎｄ ｗａｓ ａｌｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｅｌｅｖｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｅｉｍｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ＧｅｎBａｎｋ． Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ about １ ５２２ ｂｐ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ １８Ｓ ｒＤＮＡ ｏｆ Ｅ． ｍａｇｎａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｂｅｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ E. magna publicized in GenBank ｗａｓ ｍｏｓｔ ｃｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ９９．６％； and the monology between Hebei E. magna and the other 11 kinds of Eimeria infecting overseas rabbit was 92.4%~99.6%． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅ． ｍａｇｎａ； １８Ｓ ｒＤＮＡ； sｅｑｕｅｎｃｅ； pｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ aｎａｌｙｓｉｓ 　　兔球虫种类的鉴定，传统方法是以卵囊形态、致病性、寄生部位、肠道病变特征等为鉴别指标［１］，现在仍然用于兔球虫病的流行病学等研究。实践证明，单纯形态学鉴定存在一些不足，一方面由于球虫受到遗传和环境等因素的影响，这些鉴别指标有时会发生变化，因而不能作为虫种鉴别的精确指标［２］；另一方面研究过程中不同研究者对同一性状的认知存在主观差异，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，造成球虫分类鉴定上的分歧，这就给该病的诊断与防治带来了困难。 　　我国对于兔大型艾美耳球虫分子生物学特性研究的相关报道较少。因此，本研究在大型艾美耳球虫形态学鉴定的基础上，对大型艾美耳球虫目的基因１８Ｓ ｒＤＮＡ采用软件设计一对引物进行ＰＣＲ扩增，通过系统发育分析进一步确立大型艾美耳球虫种。 　　１材料与方法 　　１．１仪器及设备 　　梯度ＰＣＲ扩增仪（美国热电公司，ＩＳ－５５８０３）、高速冷冻离心机（湖南星科科技有限公司，ＴＧＬ－１６ＬＧ）、电泳仪（北京市六一仪器