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CRISPRCas9系统介导小鼠MSTN基因定点修饰的研究 　　摘要：利用CRISPR/Cas9系统突变小鼠Myostatin基因，为制备MSTN基因修饰猪奠定了理论和实践基础。结果表明，成功构建了CRISPR/Cas9定点敲除技术平台，并获得MSTN基因发生缺失突变的小鼠模型。 　　关键词：CRISPR/Cas9系统；Myostain基因；定点修饰 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）20-5155-04 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.20.058 　　Production of MSTN Gene Mutant Mice Using CRISPR/Cas9 System 　　REN Hong-yan，BI Yan-zhen， LI Li， ZHENG Xin-min 　　（Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China） 　　Abstract： In this paper， Myostatin gene mutant mice were generated using CRISPR/Cas9 system， which can be further applied to preparation of transgenic pigs. The results showed that CRISPR/Cas9 platform was established and MSTN gene mutant mice were generated successfully. 　　Key words：CRISPR/Cas9 system； Myostatin gene； site-directed mutation 　　基因敲除动物模型是开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶点的重要工具。传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体选育等步骤，不仅流程繁琐，对技术的要求很高，而且费用大、耗时较长、成功率也较低。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上时间，因此其应用受到限制。新一代人工核酸内切酶（Engineered endonuclease，EEN）的出现，使这一现状彻底改观，锌指核酸内切酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）是第一代人工核酸内切酶，其可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口[1]。截至目前，ZFN已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS细胞中[2]。第二代人工核酸酶是一类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN），可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中迅速得以应用[3-5]。 　　2013年，《Cell》杂志报道称加州大学旧金山分校的研究人员发现了一种效率更高、修饰更为精确的敲除基因的方法，称为CRISPR/Cas9系统[6]，该系统因其操作简单、成本低、效率高等特点受到国内外研究者的关注。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA[7]。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性[8]。该系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白质在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计的这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（short guide RNA），从而引导Cas9对DNA的定点修饰。2013年，美国两个实验室报道了基于CRISPR/Cas9系统在细胞系中进行基因敲除的新方法，利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变，并迅速将该技术应用于基因敲除小鼠和大鼠的制备中[8，9]。Jaenisch等利用CRISPR/Cas9系统在3～4周时间内构建出携