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云南腾冲雪鸡肌肉蛋白质组学的研究 　　摘要：腾冲雪鸡是云南省腾冲县的一个地方优良家鸡品种，具有羽毛洁白、肉骨乌黑、肉质好、抗病性强等优良特性。本研究以140日龄腾冲雪鸡为对象，采用双向电泳（DE）分析其腿肌与胸肌中蛋白表达差异，并以基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）鉴定腿肌与胸肌中差异蛋白质点。结果表明，经双向电泳图谱分析所获得的肌肉组织蛋白点分布于pH4.0～7.0之间，蛋白点清晰，图谱分辨率较好，其中腿肌中检测到1421±34个蛋白点，胸肌中检测到1329±25个蛋白点，对比分析腿肌和胸肌组织的DE图谱，发现有110个点存在明显的表达差异，在腿肌中高表达的点有56个，在胸肌中高表达的点有54个；选取的蛋白质点经鉴定为核纤层蛋白A、磷酸葡萄糖变位酶1、β-烯醇酶、超氧化物歧化酶、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、原肌原蛋白1，以及一些假设蛋白和非特征性蛋白。 　　关键词：腾冲雪鸡；蛋白质组学；双向电泳 　　中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）07-0001-05 　　腾冲雪鸡是云南省腾冲县的一个优良地方家鸡品种，产于冬季积雪的高黎贡山地区，因羽毛洁白无斑而得名。其生长速度快，体型中等，具有肉骨乌黑、味香肉嫩、抗病力强等特性。目前，研究者已从体型外貌特征[1]、血液生化指标[2]、肌肉营养成分[3]、屠宰性能[4]、肌纤维特性[5]与遗传多样性[6]等方面对其进行探讨。鉴于腾冲雪鸡是具有地方特色的家鸡遗传资源，需要从不同角度对其开展深入的系统研究。 　　蛋白质是生命活动过程的功能单位，而蛋白质组是指在特定的时间和环境条件下一个细胞内所有蛋白质的表达。由于肌肉的主要成分是水和蛋白质，因此对蛋白质组进行分析，就可获得大量的信息，进而阐明鉴定肉质的各种蛋白质的结构和功能[7-8]，并从全新的角度来分析已知的或新出现的肉质问题[9]。目前，与家禽肉质相关的蛋白质组研究还很少，且对于腾冲雪鸡肌肉蛋白质组学研究尚未见报道，本研究旨在通过双向电泳（dimensional electrophoresis，DE）分离腾冲雪鸡肌肉蛋白，分析腿肌与胸肌中蛋白表达差异，并以基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）对分离的差异蛋白点进行鉴定，为探讨腾冲雪鸡不同部位肌肉品质差异的内在机理奠定基础，并进一步为腾冲雪鸡种质资源的保护和开发利用提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　140日龄腾冲雪鸡由云南农业大学实验种鸡场提供，屠宰后分别选取腿肌和胸肌作为样品，并置于-80℃条件下待分析。 　　N，N-亚甲基双丙烯酰胺、碳酸氢铵与牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）标准品 美国Sigma公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、丙烯酰胺、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）和3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸、N，N，N，N-四甲基乙二胺（tetramethyl ethylenediamine，TEMED）、过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）与碘乙酰胺 美国Amersham公司；胰酶与十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 普洛麦（北京）生物技术有限公司；固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG）缓冲液（pH4.0～7.0） 美国GE公司；固相pH梯度（IPG）干胶条（24cm，pH4.0～7.0） 美国Bio-Rad公司；其他试剂均为国产分析纯产品。 　　1.2 仪器与设备 　　Ettan IPGphor Ⅲ等电聚焦电泳仪、Ettan DALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 美国GE公司；Powerlook1100凝胶扫描仪 美国Umax公司；Autoflex speed? MALDI-TOF/TOF质谱仪 德国Bruker Dalton公司。 　　1.3 方法 　　腾冲雪鸡腿肌和胸肌中蛋白质组分析参考文献[10]的方法并稍作修改。 　　1.3.1 蛋白质的提取及纯化 　　取1g腾冲雪鸡肉样以液氮研磨成粉，加入10倍体积-20℃预冷的10% TCA/丙酮溶液，-20℃沉降过夜，随后在4℃、12000r/min离心20min，弃上清液，沉淀物加预冷丙酮洗涤，在