交联青霉素G酰化酶聚集体制备及其催化特性的研究.docVIP

交联青霉素G酰化酶聚集体制备及其催化特性的研究 　　(1.鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025：2.山东师范大学信息科学与工程学院，山东济南250014)摘要：目的考察交联青霉素G酰化酶聚集体催化特性，探讨其应用潜力。方法以硫酸铵为沉淀剂获得青霉素G酰化酶蛋白沉淀，戊二醛交联沉淀的蛋白质制备交联酶聚集体，在此基础上研究交联酶聚集体的催化特性。结果交联粪产碱杆菌来源青霉素G酰化酶聚集体的最适反应温度55℃，最适pH 9.0，其酸碱和热稳定性均优于游离酶，重复使用13批次几乎无酶活性丢失，反应20批次后仍有50.9％的活性。结论交联酶聚集体的稳定性较游离酶好，具有一定的工业应用前景。 　　关键词：青霉素G酰化酶；交联酶聚集体；催化特性；固定化酶 　　中图分类号：0814.2 　　文献标识码：A 　　文章编号：1672-979X(2012)03-0077-05 　　青霉素酰化酶是半合成抗生素生产中关键酶，可以合成众多青霉素类和头孢菌素类抗生素。该酶在手性合成物拆分与合成方面也有很多应用，如氨基酸拆分、手性醇合成等。但采用游离酶催化反应后难以分离回收，工艺成本较高，故在工业生产中多采用固定化酶形式。酶固定化是拓宽青霉素酰化酶应用范围的重要工序。 　　自1967年首次将固定化氨基酰化酶用于氨基酸拆分工业以来，载体固定化酶技术(吸附、共价结合、包埋、微囊化等)在随后几十年间取得了很大进步，且在工业生产中有较好地应用。但由于该技术需要载体固定(载体约占固定化酶总量的90 ％,99％)，产生固定化酶“活性稀释”作用，导致低时空产率和低产量。此外，通过载体固定化通常会致使超过50％的活性损失，尤其是酶在高负载量固定过程中。由于缺乏选用固定化酶载体的理论指导，固定化酶载体要依靠实验室大量的重复优化筛选工作，往往消耗大量时间试验，且会出现许多失败的结果。相对载体固定化酶来说，非载体固定化酶技术尤其是交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregate，CLEA)具有良好的催化效能，特别是单位体积的高催化活性和不需昂贵的商业化载体等优点受到广泛关注。本文通过制备交联青霉素G酰化酶聚集体并研究其催化性能，以期为进一步应用奠定良好基础。材料与方法 　　1.1材料与设备 　　50％戊二醛(AR，上海晶纯试剂)，青霉素G钾盐和6一氨基青霉烷酸(6一APA，华北制药)；对二甲氨基苯甲醛(PDAB，AR，上海精纯试剂)；其余试剂均为分析纯。粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(Alcaligeties　ecal　penicillin G acylaset PGA)酶液，华东理工大学鲁华生物技术研究所惠赠。 　　SHA。C水浴恒温振荡器(金坛恒丰)：WFJ，7220型可见分光光度计(尤尼柯)。 　　1.2交联青霉素G酰化酶聚集体的制备 　　粪产碱杆菌青霉索G酰化酶酶液经6 000 r／rain离心10 min去除菌体收集上清，按90％饱和度加入硫酸铵。在磁力搅拌器上缓慢搅拌过夜沉淀酶蛋白。 　　经硫酸铵处理后的酶蛋白沉淀液加入50％戊二醛至终浓度为3％(w／v)，缓慢搅拌12 h充分交联酶蛋白。交联后青霉素G酰化酶经6 000 r／min离心6 min，去上清后重复洗涤离心2次收集交联青霉素G酰化酶聚集体。 　　 　　1.3酶活性测定――PDAB；：Atul 　　PDAB显色液与PGA催化青霉素G钾盐生成的6-APA作用，酸性条件下生成的黄色溶液(席夫碱)在415 nm有最大吸收。以0.1 mol／L，pH 7.8的磷酸钾缓冲液为反应介质，以4％(w／v)青霉素G钾盐作底物，于37℃用酶水解5 min，单位酶(mL或g)每分钟水解青霉素G钾盐产生l p,mol 6-APA所需的酶量为1个酶活性单位。 　　 　　1.4交联青霉素G酰化酶聚集体的结构表征 　　真空冷冻干燥交联青霉素G酰化酶聚集体，电子显微镜下观察交联青霉素G酰化酶聚集体的表面结构。 　　 　　1.5交联青霉素G酰化酶聚集体的催化特性 　　在不同反应体系和反应条件下，分别比较测定交联青霉素G酰化酶聚集体和游离酶的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、酸碱稳定性、批次反应过程和批次稳定性。 　　2结果与分析 　　2.1扫描电镜形态观察 　　在放大250和3 000倍电镜图下可较清楚的看到聚集体的整体形状，交联青霉素G酰化酶聚集体结构紧密，分子间缝隙有利于底物分子和产物的内外扩散，使交联青霉素G酰化酶聚集体保持良好的催化活性。酶蛋白在交联剂的作用下形成不溶性酶聚集体，这种多孔且稳定酶聚集体的结构，使得操作中具有便于回收重利用以及生产能力和稳定性都较高的优点。 　　 　　2.2不同pHT交联青霉素G酰化酶聚集体与游离青霉素G酰化酶催化活性比较