交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理的方法结合液相色谱串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原.docVIP

交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理的方法结合液相色谱串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原 　　摘要[HTSS]建立了红葡萄酒酪蛋白过敏原的质谱分析方法。选择专一性SRM离子对，建立3种亚型酪蛋白αS1， αS2， β的质谱定性与定量方法；利用交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）处理红葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，使前处理缩短到2 h以内。结果表明，酪蛋白的回收率提高到80%以上，检出限达10 μg/L。 　　1引言 　　引起过敏的物质称为过敏原，一般为蛋白质类物质。随着食物过敏患者的增多，以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果，已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法，包括核酸法（PCR）和酶联免疫法（ELISA）等。新兴的质谱法（MS）灵敏度高、假阳性概率低，并具有方法开发快速、运行成本低等优势。 　　葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质，使酒液获得长期稳定性。酪蛋白是常用的澄清剂之一。酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原，残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。但是葡萄酒，特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质，单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用，有很强的蛋白结合能力。单宁常用作酶抑制剂使酶失活。单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解，传统蛋白提取方法（超滤、透析、有机溶剂沉淀等）用于葡萄酒时回收率只有20%-30%[1，2]。因此，关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少，研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒，对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略[3，4]。已报道的方法如十二烷基硫酸钾（KDS）法、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）法等，提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质，工作量大，分析通量低，蛋白质的回收率很低[5，6]。 　　交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）是PVP交联后形成的颗粒（约110 μm），具有很强的吸附能力[7]。PVPP竞争性地与单宁结合，释放蛋白，可以有效去除单宁等多酚类物质[8，9]。本研究利用PVPP建立了快速、高效的红葡萄酒蛋白提取与酶解方法，使前处理时间缩短到2 h之内，回收率达到80%以上。将本方法与三重四极杆液相色谱串联质谱联用（LCMS/MS）结合，分析了红酒中3种亚型的酪蛋白，检出限达到10 μg/L，比目前报道的方法提高了至少一个数量级[3]。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　TSQ Vantage三重四极杆质谱、Ultimate 3000超高效液相色谱（Thermo公司）。α酪蛋白（αCasein）、β酪蛋白（βCasein）、胰蛋白酶（Trypsin）、PVPP、NH4HCO3购自SigmaAldrich公司；乙腈、甲酸购自Fisher公司；红葡萄酒商品若干。 　　2.2蛋白提取与酶解 　　样品制备：取红酒200 μL与酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 μg/L）充分混匀后（添加量为100 μg/L时），加入200 μL PVPP混悬液（100 g/L，溶于0.5 mol/L NH4HCO3溶液），并于30 ℃振荡反应15 min。反应后，直接加入2 μL Trypsin （200 μg/L），并于37 ℃振荡酶解1.5 h。 　　酶解完成后，于20000 g离心5 min，取上清液。沉淀加入100 μL水，振荡超声2 min，再于20000 g下离心5 min，将溶液完全取出。两次溶液合并后，再次20000 g离心，取上清液直接进样分析。 　　对照品制备：第一步不加酪蛋白，前处理完成后、进样前，再加入Trypsin酶解后的酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 mg/L ，添加量为100 μg/L）， 混匀后直接进样分析。 　　2.3LCMS/MS分析 　　第10期张 伟等： 交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液相色谱串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原 　　2.4数据处理 　　酪蛋白亚型序列来自SwissProt数据库； 专一性肽段与特征性碎片选择及碰撞能量优化由PinPoint软件（Thermo）分析，结合LTQOrbitrap 高分辨质谱（Thermo）全扫描确证获得； 质谱数据由Xcalibur Qual Browser软件（Thermo）进行定性分析，由Xcalibur Quan Browser软件（Thermo）进行定量分析。 　　3结果与讨论 　　3.1酪蛋白LCMS/MS方法建立 　　酪蛋白有α和β两种主要亚型，其中α包含S1和S2两种亚型。由于αS1， αS2和β三者序列完全不同，并同时具有致敏性，因此同时针对这3种酪蛋白建立LCMS/MS分析方法。根据Pinpoint软件分析，从3种酪蛋白中分别选择两条特征性肽段，每条特征性肽段分别选择两个子离子，即每种亚型对应4对离子对，