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亲水的作用液相色谱法测定板蓝根颗粒中腺苷含量 　　摘要：采用自制的负载纳米碳（CNPs）的亲水色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒径，10 nm 孔径），建立了亲水作用液相色谱法（HILIC）测定板蓝根配方颗粒中腺苷含量的方法。结果表明：腺苷浓度在 2.5～20.0 μg/mL时，腺苷浓度与亲水作用液相色谱法测定的峰值线性关系良好，平均回收率97.63%，RSD=4.08%（n=9）。所建立的亲水作用液相色谱法分离效果好、快速简便、准确，结果可靠，可为进一步完善板蓝根颗粒制剂的质量控制标准提供依据。 　　关键词：亲水作用液相色谱；板蓝根颗粒；腺苷；方法学验证 　　中图分类号： O655；O657.7+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0284-03 　　收稿日期：2013-09-29 　　基金项目：宁夏大学科学研究基金（编号：ZR1207）。 　　作者简介：李媛媛（1980―），女，宁夏中宁人，博士，讲师，主要从事天然植物和药物有效成分的分析与分离研究工作。E-mail：liyy@nxu.edu.cn。板蓝根颗粒为板蓝根单味药材水提醇沉加工而成，具有清热解毒、凉血利咽之功效[1]。板蓝根配方颗粒作为防病治病的物质载体，是一个极其复杂的混合物体系，其主要化学成分有：靛蓝、靛玉红、丁香酸、喹唑酮酸、精氨酸等[2]。目前，中国药典对板蓝根的现行标准只检测告依春。有报道采用测定靛蓝或靛玉红的含量来控制其质量[3]，由于板蓝根颗粒采用水提醇沉工艺，而靛蓝或靛玉红为脂溶性成分，因此靛蓝或靛玉红含量的多少难以客观、准确地表征该制剂的内在质量。已有研究结果表明，板蓝根配方颗粒中水溶性核苷类成分――腺苷也是板蓝根中抗病毒的活性成分之一，具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心率不齐的作用，并且其含量能够反映板蓝根中核苷类的含量水平，可以作为评价板蓝根配方颗粒的一种指标[4]。 　　关于核苷类物质含量测定的常用方法是RPLC法和CZE法，但是RPLC只是依靠单一的疏水作用力来实现物质的分离，对极性物质无法保留或者保留很弱。虽然可以使用正向色谱来分析，但是正相色谱通常使用非极性的溶剂做流动相，极性的分析物很难溶解于非极性的流动相，而且与质谱也不兼容。因此，极大的限制了正相色谱的应用。亲水作用色谱（HILIC），是一种新型的色谱模式。类似于正相色谱，在亲水色谱柱上，极性化合物有强保留。不同之处在于，正相色谱所使用的非极性流动相体系被水和有机溶剂的体系所代替。这样就可以解决极性和亲水性分析物在正相色谱体系中不溶解的问题，并且与质谱也有好的兼容性[5-7]。亲水作用色谱，作为对反相色谱的补充和正相色谱的替代，已经显示出巨大的优越性和潜力，成为分析极性和亲水性化合物的一种强有力的色谱技术[8-9]。 　　目前，使用亲水作用色谱检测板蓝根中腺苷含量未见报道。本研究在自制的亲水作用色谱柱上，固定相以硅胶为载体，负载纳米碳（CNPs）作为固定相[10]，应用HILIC法测定板蓝根中腺苷含量，为完善板蓝根的质量标准提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　色谱分析在瓦里安高效液相色谱仪 （Varian，美国） 上完成。仪器由2台 Prostar 210型高压梯度泵、1个77251型进样阀（配备20 μL进样环）、1台Prostar 325型紫外检测器和1套色谱数据分析系统（Starws）组成。超声清洗器购买于昆山禾创超声仪器有限公司。 　　试验过程中使用的超纯水均来自MILLI-Q超纯水系统（Millipore，Bedford，MA，美国）。高效液相色谱仪器的流动相为乙腈 （色谱级，迪马科技，美国） 和超纯水的混合物，流动相和测试化合物在使用前均使用0.45 μm的过滤膜过滤。对照品腺苷购买于国药集团化学试剂有限公司。板蓝根颗粒1袋（10 g），市售。 　　1.2腺苷保留行为考察 　　在HILIC中，流动相的洗脱强度对极性和亲水性化合物的保留有最大的影响，因为随着流动相极性的减小，亲水作用逐渐增强。如图1所示，当流动相中乙腈含量从50%增加到80%时，腺苷的保留值逐渐增加。当乙腈含量增加至80%以上时，腺苷的保留值显著增加，这主要受亲水作用控制，是典型的HILIC 的特征。当流动相中乙腈含量小于50%时，化合物的保留随着流动相中乙腈含量的减少而增加，这主要受疏水作用控制。当流动相中乙腈含量为50% 时，分析物在固定相上的保留是最弱的，这是RPLC和HILIC两种色谱模式的分界线。因为当乙腈含量为50% 时，水和乙腈都在固定相表面达到饱和，液液分配作用或者吸附作用都是最弱的。类似的“U”形保留曲线，在许多亲水固定相上观察到[11-12]，这是混合保留模式的典型特征。