呼吸系统疾病微生物检测中多重PCR技术的应用分析.docVIP

呼吸系统疾病微生物检测中多重PCR技术的应用分析 　　【摘 要】多重聚合酶链式反应（PCR）技术主要是通过同时对几个不同DNA片段进行扩增处理，从而检测微生物水平。引起具有检测快速、高效、便捷、高敏感性及高特异度等优势，被广泛应用于各项实验室检查诊断中。本文就多重PCR技术的原理及其在呼吸系统病原微生物检测中的应用进行了综述。 　　【关键词】 呼吸系统疾病；病原微生物；多重聚合酶链式反应 　　呼吸系统感染性疾病在临床中较为常见，发病率及病死率均较高。临床研究显示，全球因急性呼吸道感染所致死亡人数位列第三，仅次于心血管疾病和脑血管疾病。诱发呼吸道感染性疾病的病原微生物种类繁多，主要有真菌、细菌、病毒、衣原体以及支原体等，且部分患者存在多重感染，这为临床诊断与治疗造成了较大的难度[1]。多重聚合酶链式反应（PCR）技术是在常规PCR技术的基础上发展而来，能够对特异性引物的多个不同DNA片段进行同时扩增，从而有效提高了检测效率与准确度，具有检测快速、准确、污染少、特异度以及灵敏度高等优点[2]。应用多重PCR技术能够同时测定多重病原菌，降低了荧光染料以及酶等的用量，从而节约了临床检测成本。本文就多重PCR技术在呼吸系统病原微生物检测中的应用作一综述，以飨读者。 　　1 呼吸系统病原微生物的临床检测方法 　　精确的病原学分析是呼吸系统感染性疾病临床诊断的主要依据，同时也是临床合理选择用药的基础。目前，临床所用病原学检测技术主要包括病原体培养法、分子生物学法以及免疫学法等，但多无法满足临床诊断和治疗的需求。其中，病原菌分离培养法是既往病原菌感染疾病中病原学诊断的“金标准”，但其主要适用于细菌感染的检测，而对于衣原体及病毒等的培养难度较大，存在分离培养时间长以及阳性率低等问题。此外，在标本采集、运送以及接种过程中存在较多的影响因素，容易导致检测结果误差[1]。分子学生物技术对于病原微生物的检测虽然具有较高的特异性与敏感性，但往往适用于单一微生物的检测，对于病原微生物种类复杂的呼吸系统感染性疾病，临床诊断难度较大。免疫学法操作简便，但在进行病原体抗原检测时，对于单克隆抗体的质量要求较高，且只能进行单一检测。在抗体检测过程中，检测结果受到抗体产生时间以及抗体滴度水平等的影响，检测结果存在较大的偏差。此外，免疫法检测的阳性结果存在滞后现象，不适用于疾病的早期诊断[3]。因此，寻找一种快速、有效、低成本、高效率且特异性度高等特点的方法具有重要意义。 　　2 多重PCR技术的概念与作用原理 　　多重PCR技术是指在同一反应体系中，针对特异性因素的多个不同DNA片段进行同时扩增处理的一种检测技术[2]。与常规PCR技术不同之处在于，多重PCR技术要求在同一个反应体系之中，同时引入≥2种引物分别进行特异性扩增，从而获取目标片段，技术难度较高。多重PCR技术并非单一PCR的混合，而是通过对目标产物实施系统化的分析以及反复试验，从而建立起一种科学合理的反应条件以及反应体系[3]。其不仅保留了常规PCR技术的高敏感性以及特异性，同时也简化了操作流程，降低了试剂用量，节约检测成本。目前，多重PCR技术已经在临床各类感染性疾病的诊断中获得了广泛应用，为混合感染的临床诊断与鉴别创造了良好条件。 　　3 多重PCR技术在呼吸系统病原微生物检测中的应用 　　呼吸系统感染性疾病主要可分为上呼吸道感染性疾病以及下呼吸道感染性疾病两类。其中，上呼吸道感染多是由于细菌感染或者病毒感染所致，而下呼吸道感染除细菌及病毒感染外，衣原体、支原体以及军团菌感染也较为常见，临床诊断难度较大[2]。 　　3.1 细菌病原体的PCR检测 　　多重PCR技术对于细菌病原体的检测既往多应用于胃肠道感染性疾病，例如沙门菌感染、大肠埃希菌感染以及链球菌感染等。王小红等[4]采集75例外科ICU机械通气合并呼吸机相关性肺炎或者呼吸机相关性肺炎-支气管炎患者的痰液标本，采用多重PCR技术进行检测，对于5种常见致病细菌的检出率均在80%以上，检出率显著高于普通PCR检测以及细菌培养检测结果。认为多重PCR技术应用于呼吸系统细菌感染的检测相比于传统PCR技术以及细菌培养具有更高的准确率，能够节省临床检查人力与财力。 　　3.2 病毒病原体的检测 　　Cant等[5]研究显示，约有90%-95%的急性呼吸系统感染性疾病是由于病毒感染引起，且所感染的病毒病原菌多具有较强的感染力，一旦感染具有潜伏期短、病情发展迅速以及传播快速等特点，严重威胁患者的生命健康。因此，选择应快速高效且高通量的检测方法对于早期快速准确的诊断以及治疗决策具有重要意义。SYBR GREEN Ⅰ是多重实时PCR检测的主要原理之一，双链DNA与荧光染料结合后发出较为明显的荧光，而处于游离状态的染料通常只会发出微弱荧光