乙酰乳酸合成酶基因的克隆与高效表达-微生物学报.PDF

微生物学通报 NOV 20, 2012, 39(11): 1589−1596 Microbiology China © 2012 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ 研究报告 乙酰乳酸合成酶基因的克隆与高效表达 * 金美娟 吴坚平 徐刚 杨立荣 (浙江大学 化学工程与生物工程学系 浙江 杭州 310027) 摘 要: 【目的】乙酰乳酸合成酶(ALS)是异丁醇生物合成中的关键酶, 实现ALS 的高效 表达对调控异丁醇代谢途径有重要意义。【方法】根据GenBank 中ALS 的基因序列(alsS) 设计引物, 以枯草芽孢杆菌 168 基因组 DNA 为模板通过PCR 扩增技术得到目标酶基因, 目的片段全长为1 713 bp。将alsS 连接到pET-30a(+)上, 得到重组质粒pET-30a(+)-alsS, 并 在Escherichia coli BL2l(DE3) 中实现表达。【结果】对表达条件进行了优化, 获得最佳表 达条件为: 诱导温度 30 °C, 诱导起始菌体 OD600 为 0.6−0.8, 诱导剂 IPTG 浓度为 1 mmol/L, 诱导时间为 6 h 。表达的乙酰乳酸合成酶大部分以可溶性形式存在于菌体内, 优化后酶活可达到24.4 U/mL, 比优化前提高了7.13 倍。经HisTrapTMFF 亲和层析后获得 电泳纯的ALS, 比活为95.2 U/mg 。【结论】ALS 的有效表达为在大肠杆菌体内构建异丁 醇代谢途径打下了基础。 关键词: 枯草芽孢杆菌, 乙酰乳酸合成酶, 异丁醇 Cloning and effective expression of acetolactate synthase * JIN Mei-Juan WU Jian-Ping XU Gang YANG Li-Rong (Department of Chemical and Biological Engineering , Zhejiang University, Hangzhou , Zhejiang 310027, China) Abstract: [Objective] Acetolactate synthase (ALS) is the key enzyme in isobutanol biosyn- thetic pathway. Efficient expression of ALS is of great significance for the regulation of iso- butanol metabolic pathway. [Methods] The acetolactate synthase gene (alsS) from Bacillus 基金项目：国家 973 计划项目(No. 2011CB710800) *通讯作者：Tel: 86-571 : wjp@ 收稿日期：2012-02-20; 接受日期：2012-04-17 1590 微生物学通报