病毒学- 病毒的检验-医学课件.ppt

根据样本的稀释度和空斑数,计算每毫升空斑形成单位(PFU),即可确定病毒的滴度。 为了尽量减小计算病毒滴度的误差,进行空斑试验时应对病毒液做系列稀释,依据细胞培养板(瓶、皿)的面积,仅计算含20~100个空斑的培养板,因超过100个空斑的培养板会导致计数不准确。 空斑试验是纯化和滴定病毒的一个重要手段,只是并非所有病毒或毒株都能形成空斑。 * 2.终点稀释法 终点稀释法〈endpoint dilution assay)用于测定几乎所有种类的病毒滴度,包括某些不能形成空斑的病毒,并可用以确定病毒对动物的毒力或毒价。 将病毒做系列稀释,选择4~6个稀释度,接种一定数量的细胞、鸡胚或动物,每个稀释度做3~6个重复。使用细胞培养,可通过CPE来判定组织培养半数感染量(TCID50)。 在鸡胚或动物,是以死亡或发病来测定。 动物实验：以感染发病作为指标时,可计算半数感染量(ID50);以体温反应作为指标时,可计算半数反应量(RD50) 。 用鸡胚测定时,可计算鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50) * 3.荧光-斑点试验 是空斑试验的一种改良方法,用于测定细胞培养时不会引致CPE的病毒滴度,如猪瘟病毒。 该方法的起始步骤与空斑试验一致.在病毒充分吸附和基因表达之后,用甲醇或丙酮固定细胞,用针对病毒蛋白的抗体进行处理,然后加入荧光素标记的二抗。 将细胞置荧光显微镜下观察,病毒感染细胞形成荧光斑点,病毒的滴度以每毫升荧光斑点形成单位。 * 4.转化试验 用于测定某些不形成空斑的反转录病毒的滴度。 Rous肉瘤病毒转化鸡胚细胞就是一个例子. 受到转化的细胞可形成小的斑点,容易与其余的单层细胞相互区别。 感染性以每毫升斑点形成单位（focus-forming unit，FFU ）表示。 * 三、病毒颗粒的检测 方法：电镜技术、血凝试验、病毒酶活性测定、绿色荧光蛋白标记 最直观的方法是用电子显微镜（electron microscopy，EM）观察病毒颗粒 病毒浓度要求：﹥107 如：某些病毒料中含毒量较高,如轮状病毒引致的腹泻的粪便,EM观察较易发现病毒,但像口蹄疫病毒或猪瘟病毒,病料中一般含毒量较低,EM不作为常规检验手段。 1、电镜技术 * 免疫电镜(IEM) 免疫电镜(IEM)技术是应用病毒的特异抗体的电镜技术,可检出某些凭形态特征较难区分的病毒。 由于抗体与病毒颗粒相结合,凝聚了样本中的病毒。可提高检出率。 高滴度的抗血清或单克隆抗体是决定IEM成败的关键材料。 * 2、血凝试验 许多动物病毒,如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成员,能够凝集某些动物(如鸡、小鼠、豚鼠)或人的红细胞。 这些病毒含有可与红细胞结合的蛋白质,如禽流感病毒的囊膜上有一种称为血凝素的糖蛋自,可与红细胞表面的N-乙酰神经氨酸糖蛋自结合,引起红细胞凝集。 利用这种特性,可做血凝试验来检测这些病毒的存在。 * 一般将病毒液在血凝反应板上做倍比稀释,加入红细胞,未凝集的红细胞呈圆点或纽扣状沉于孔底,而凝集的红细胞弥漫性格状覆盖整个孔。 该方法快速,但如犬细小病毒检验样本中的病毒粒子含量若少于lO9/g,敏感性则差。 ++++：血球完全凝集，成厚膜状铺于管底。 +++： 血球呈薄层贴附于管底，边缘不整齐。 ++： 中央呈小圆盘状，边缘凝集呈颗粒状。 +： 中央呈弥散圆盘状，边缘有少量凝集颗粒。 —： 无凝集，血球自然沉于管底呈一小圆盘状。 * 3、病毒酶活性测定 一些动物病毒含有核酸聚合酶，可将病毒与放射性标记的前体混合,测定其放射性活性,该方法常用于反转录病毒的反转录活性的检测,因它们不能转化细饱,也不能形成空斑。 因酶活性与病毒粒子数量成比例关系,因此该方法可以快速跟踪感染过程中病毒的增殖侑况。 * 4、绿色荧光蛋白标记 用于检测病毒的转录或翻译过程,在活细胞中可直接观察到，不需要固定细胞,也不需要底物或酶。 可将绿色荧光蛋白的基因序列插入病毒基因组,不影响病毒蛋白的功能,用重组病毒感染细胞后,即可产生绿色荧光蛋白。 可用于研究病毒的亚细胞定位,分析病毒在活细胞中的吸附、侵入、脱壳、复制、装配和释出过程. * 四、病毒的血清学诊断 原理是用已知病毒抗原来检测病人或动物血清中有无相应抗体，故须待病人或动物感染后体内产生抗体时才能检出。 另外，在采取临床标本及病人、动物血清应注意病程，必须采取患者急性期血清与恢复期血清 (双份血清) 进行血清学试验。若第2次血清抗体滴度比第1次高出4倍以上时，才有诊断意义。 * 血清学技术 1、免疫荧光技术 2、酶联免疫吸附试验（ELISA） 3、免疫沉淀技术 4、免疫转印技术 5、中和试验 6、血凝试验和血凝抑制试验 7、补体结合试验 * （一）病毒抗原的直