二甲双胍抑制人胃癌细胞增殖及迁徙的初步研究-内科学(消化系病)专业论文.docxVIP

第一部分 二甲双胍干预浓度确定以及对胃癌细胞增殖的 影响 引 言 胃癌是常见的消化系统肿瘤，在世界范围内，其发病率和死亡率均居所有恶 性肿瘤前列?而尤其在亚洲，胃癌是发病率排第二位的恶性肿瘤?我国的胃癌患 者数量相当庞大，比例达到全世界胃癌患者的大约 40%[10]?可见，胃癌仍然是严重 威胁人类健康的一大疾病? 胃癌的治疗也是相当棘手的一个问题，各种治疗方法仍在进行不断的探索? 优化?从单用一种药物到联合化疗，目前还是没有真正找到一种疗效满意的方案? 而且胃癌常用的化疗药物如 5-氟尿嘧啶，其副作用又是不容忽视的一个方面?如 何能够在保证疗效的前提下，尽量减少化疗药物的用量，减轻药物副反应，是值 得我们努力解决的问题? 二甲双胍作为一线的糖尿病药物，用来帮助 2 型糖尿病患者控制血糖已经有 几十年的历史，药物的安全性得到广泛的认可[11]?近几年来，多项研究发现糖尿 病患者可能与较高肿瘤发生率相关[2，12-14],而进一步的研究显示糖尿病药物治疗选 择的不同能够影响肿瘤发生率，二甲双胍的应用相比其他糖尿病药物比如胰岛素 或者磺脲类能够降低糖尿病患者的肿瘤发生以及改善生存率[2,15-18]? 从这些前期的研究我们可以察觉到，二甲双胍在肿瘤疾病的应用似乎能够看 到比较广阔的前景?然而这些前瞻性研究较多的是在其他类型的肿瘤进行，并且 多数是临床队列研究以及流行病学调查，二甲双胍能够降低这些肿瘤的发生率是 通过什么具体机制，目前仍不十分明确?这些研究的研究对象也大部分是针对糖 尿病肿瘤病人，那么二甲双胍对于单纯肿瘤病人是否也能发挥肿瘤抑制作用呢？ 尤其是对于胃癌这样一种实体肿瘤，尚未有文献提示二甲双胍是否同样具有减少 发病率的效用，也未见基础的实验室研究揭示这种作用? 于是，我们通过选取胃癌细胞系，应用不同浓度二甲双胍在不同时间点进行 干预，在观察药物作用的同时，确定后续实验的药物作用浓度，以便进一步检测 二甲双胍对胃癌细胞生存?迁徙的影响? 材料与方法 1.主要试剂与材料 （1）RPMI1640 培养液（GIBCO） （2）胎牛血清（GIBCO） （3）青链霉素双抗（GIBCO） （4）EDTA-胰酶（GIBCO） （5）二甲双胍（Sigma） （6）3-(4,59 二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（Sigma） （7）二甲基亚砜（DMSO）（Sigma） （8）细胞培养瓶（Costar） （9）96 孔细胞培养皿（Costar） 2.主要仪器设备 （1）细胞操作超净台 （2）CO2 培养箱 （3）倒置显微镜（Olympus） （4）酶联免疫检测仪（Thermo） （5）温度孵育箱 （6）可调速摇床 （7）电子称量仪 3.研究方法 3.1 细胞培养 3.1.1 冻存细胞复苏 （1）将细胞冻存管从液氮中取出，迅速放入 37?恒温水浴箱轻轻摇晃，大约 20-60 秒待其融解? （2）将冻存管用 75%医用酒精消毒外表面及管口，于超净台中靠近酒精灯外焰， 打开管口? （3）吸出细胞悬液，注入高压灭菌处理过的离心管，并加入 5ml 完全培液，充分 混匀后 1000rpm，10min 离心沉淀细胞，弃上清? （4）新鲜完全培养液重悬细胞，轻柔混匀后铺板，在显微镜下观察细胞形态，置 含 5%CO2 的 37?恒温培养箱，次日换液? 3.1.2 常规细胞培养 （1）细胞常规培养于含 10%胎牛血清及 100U/ml 青霉素?100μg/ml 链霉素的 RPMI1640 培养液中?培养环境为 37?，5%CO2 的饱和湿度无菌恒温培养箱?注意培 养箱温度及 CO2 浓度指示?两天换一次新鲜培液?培液自 4?冰箱取出后，可放 37 ?水浴箱预热或室温放置待恢复至室温? （2）细胞生长状态较好，在培养瓶中密度达到 80%左右，进行细胞传代?在超净 台中，吸走完全培养液，加少量 0.25%胰酶-EDTA，稍加摇晃洗涤，洗去残留培养 液，弃去?另加入 1ml0.25%胰酶-EDTA，倒置显微镜下观察，待细胞形态开始收缩， 加入 2ml 培液中和，轻柔吹打，将细胞从贴壁状态吹成悬浮，收集至无菌离心管， 1000rpm，10min 离心沉淀细胞，弃上清?加入 3ml 新鲜完全培养液，充分吹匀? 吸取 1ml 加至新培养瓶，继续加入 4ml 新鲜完全培液，轻柔吹匀，盖上瓶盖，避 免拧紧，在超净台台面画 8 字移动混匀?显微镜下观察细胞形态及分布，转至恒 温培养箱培养? 3.2 药物干预 3.2.1 二甲双胍储存液配置及分装 （1）在电子称量仪称取空无菌离心管重量? （2）于超净台中用无菌药匙取二甲双胍药粉置入离心管中，称取总质量，减去空 离心管质