促性腺激素释放激素在斑节对虾中的免疫定位及功能-渔业专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 主席 委员 委员 委员 委员 秘书 答辩地点 南海水产研究所 答辩日期 促性腺激素释放激素在斑节对虾中的免疫定位及功能 摘 要 斑节对虾（Penaeus monodon）是我国重要的传统养殖虾类，但由于对其性腺 发育调控机制的了解不清晰，育种过程中缺乏人工可控的性腺催熟技术，育种技 术理论的升级受到制约。因此，了解性腺发育过程中的调节机制，探索发育相关 激 素 的 分 泌 规 律 及 作 用 机 制 有 重 要 意 义 。 促 性 腺 激 素 释 放 激 素 (gonadotropin releasing hormone, GnRH)是一种十到十二肽的神经激素，在动物的繁育中发挥重要 作用。为了获知 GnRH 的在斑节对虾神经系统中的分泌规律、功能和作用机制， 本研究利用组织切片，免疫组化，体外组织培养，反向液相色谱等方法研究了 GnRH 在斑节对虾神经系统中的分布及变化，确定了 GnRH 对卵巢发育成熟的诱导作用， 并初步建立了斑节对虾 GnRH 分离纯化的方法。具体研究结果如下： （1）斑节对虾神经系统和卵巢组织结构 通过石蜡切片，HE 染色的技术研究了斑节对虾神经系统及卵巢的形态学及组 织学结构。结果表明斑节对虾神经系统是由脑，围食道神经，胸神经及腹神经节 高度愈合而成，脑位于眼柄基部，由前脑，中脑，后脑和相连的神经束组成，脑 中神经分泌细胞根据直径分为三类，分别为小型，中型及大型神经分泌细胞，根 据在脑中的分布位置分为 6-17 神经分泌细胞群。在食道下神经，胸腹神各神经节 也是由神经纤维及神经分泌细胞组成。斑节对虾卵巢分为六个期，其中成熟期（V 期）卵子呈皮质杆状体。卵巢具有自发荧光现象，主要集中于滤泡细胞以及富含 卵黄颗粒的次级卵母细胞、成熟卵母细胞的细胞质区域, 荧光强度与卵巢发育阶段 具有显著正相关性（P0.01）。可根据荧光强度初步判断卵巢发育分期。 （2） GnRH 在斑节对虾生殖发育期神经系统及卵巢中免疫定位 利用免疫组化及定量 PCR 的方法研究了 GnRH 在斑节对虾卵巢发育五个时期 （II 至 VI 期）中在神经系统及卵巢中的免疫定位，以及在卵巢和肝胰腺中卵黄蛋 白原的表达规律。结果显示阳性信号主要分布于脑、胸神经节的一些中型神经分 泌细胞群，并且 GnRH 免疫阳性在各神经节的神经纤维中普遍分布，同时在次级 卵母细胞也检测到免疫阳性。其次，GnRH-I 类似物在斑节对虾 III 期脑组织中显 示较强的免疫阳性，显著聚集在中型神经分泌细胞细胞质中，呈现高表达水平； 然而在卵巢中 GnRH-I 类似物仅在成熟期 V 期次级卵母细胞与初级卵母细胞的细 I 胞间隙中发现免疫阳性。定量 PCR 结果显示在发育不同时期中，肝胰腺卵黄蛋白 原 mRNA 表达趋势与卵巢中不同，提示斑节对虾神经系统分泌 GnRH-I 型类似物， 诱导卵巢成熟，在此过程中，肝胰腺卵黄蛋白原向卵巢转移。 （3）GnRH 体外培养对斑节对虾卵巢发育的影响 采用离体卵巢组织培养的方法研究了中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）促性腺 激素释放激素（EsGnRH-I）、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)促性腺激素释放激素 （PcGnRH），多巴胺拮抗物地欧酮（DOM）及神经组织对斑节对虾卵巢发育的调 控作用效果。结果表明：50 ng?ml-1 EsGnRH-I，500 ng?ml-1 PcGnRH，0.3 μg?ml-1 DOM 对离体卵巢的发育有明显的刺激作用，显著增大卵母细胞直径（P0.01）， 与脑组织，胸神经处理组效果相似；同时组合使用 PcGnRH 和 DOM 能极显著促 进卵母细胞发育（P0.01）。荧光定量 PCR 结果显示 PcGnRH 和 DOM 处理后能 显著增加卵黄蛋白原的积累量。说明甲壳类动物 GnRH 和 DOM 均能促进斑节对 虾卵母细胞成熟，并具有协同作用。 （4） 斑节对虾脑组织 GnRH 的初步分离纯化 采用反向液相色谱的方法对斑节对虾脑组织中 GnRH 类似物进行初步分离， 调节初步分离的纯化参数，得到理想的分离图谱，并利用 EsGnRH 抗体对分组分 进行斑点免疫实验鉴定。结果表明，斑节对虾卵巢发育初期即 II 期和 III 期，脑组 织粗提液分离组分较多，且在优化的条件下，22-26min 收集的组分具有免疫阳性， 初步确定小量分离纯化方案。该研究为大量纯化并剖析斑节对虾 GnRH 氨基酸结 构提供数据基础。 关键字：GnRH，斑节对虾，免疫组化，组织培养，卵黄蛋白原，反向液相色谱 II The immunolocalization and function of Gonadotropin-re