朵丽蝶兰生物钟相关基因DhLHY的克隆与功能验证-园林植物与观赏园艺专业论文.docxVIP

Zhejiang A F University Dissertation for the Degree of Master Isolation and Functional Confirmation of DhLHYof a Doritaenopsis hybrid Involved in the Regulation of Flowering Candidate: Haiyan Li Adviser: Yongyi Cui Speciality: Garden Plant Ornamental Horticulture Date of Submission: June , 2014 Zhejiang AF University Lin’an, Zhejiang province, P.R.China June , 2014 独 创 性 声 明 本人声明，所呈交的学位论文，是受国家自然科学基金项目（编号资助，在 指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标 注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含 在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献 的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为， 由本人承担应有的责任。 学位论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印 件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其 他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。□ 不保密, 本学位论文属于不保密。 □ （请在方框内打―√‖） 学位论文作者亲笔签名： 日 期： 指导教师亲笔签名： 日 期： 摘 要 朵丽蝶兰（Doritaenopsis hybrid）是蝴蝶兰(Phalaenopsis)与朵丽兰（Doritis）的 杂交种，是兰科蝴蝶兰属多年生附生草本花卉；因其花形酷似蝴蝶、花色丰富艳 丽，花期长达 3～4 个月，在国内外花卉市场上深受欢迎，被誉为―兰中皇后‖，是兰 科植物中栽培最广泛、应用最普及的种类之一，具有较高的观赏价值和经济价值。 本次试验通过对蝴蝶兰文库中 LHY 相关序列的搜索分析，以朵丽蝶兰?Tinny Tender‘ (Doritaenopsis ?Happy smile × Happy valentine‘)为试材，利用基因克隆技术获 得 DhLHY 基因的 cDNA 全长，对序列进行生物信息学分析并验证其功能。研究主要 取得以下结果： 1.利用 PCR 技术克隆获得朵丽蝶兰中 DhLHY 基因的 cDN A 全长;DhLHY 基因的 cDNA 序列全长 2594bp，包括一个 1962bp 的 O RF 区，编码 653 个氨基酸。 2.通过实时定量 PCR 分析比较低温和高温条件下，植物根、茎、叶中 mRNA 表 达量的变化，解析生物钟基因 DhLHY 的表达机理，分析 DhLHY 基因表达的时空分 布，结果显示 DhLHY 基因在 24h 内表达量随着光照时间的变化发生改变，在光照 2h 后表达量达到高峰，之后随着光照时间增加，表达量逐渐下降，在傍晚时分达到 低谷，进入暗期后，表达量又开始缓慢上升；在整个营养生长阶段，DhLHY 在根、 茎和叶中都有检测到表达，且表达量变化不显著，在低温处理时，DhLHY 的表达量 高于高温处理。 3.采用蘸花法侵染拟南芥，将构建的 pC1301-DhLHY 过量表达载体，转入野生 型拟南芥中，利用潮酶素筛选转基因拟南芥植株并观察记录其表型变化，结果表 明，DhLHY 转基因拟南芥植株的叶型与野生型相比，叶柄缩短，叶片变小，植株的 开花时间也有不同程度的延迟，在转基因植株体内均能检测到 DhLHY 基因的 DNA 和 RNA，这一结果与拟南芥中的研究报道大致相同。 本研究对于实现通过基因工程手段来人工控制蝴蝶兰开花的时间、突破蝴蝶兰 开花的温度限制的瓶颈有着重要意义，同时也将对蝴蝶兰产业的可持续发展起到积 极推动的作用。此外，目前国内外蝴蝶兰成花基因程度方面的研究还比较少，尤其 是对其生物钟相关机理的研究更不多见，对蝴蝶兰开花分子机制的研究具有一定的 前瞻性和创新性，有很大的研发潜力和广阔的市场前景。 关键词：朵丽蝶兰，DhLHY，克隆，实时定量 PCR，转基因 I ABSTRACT ABSTRACT Doritaenopsis, a perennial epiphytic herbaceous flo wer that belongs to Orchida