二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌细胞增殖 迁移及侵袭-病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

本研究基金资助项目 1、国家自然科学基金2、湖南省自然科学基金 07JJ3033 3、湖南省教育厅科学研究重点项目 09A077 4、湖南省科技厅科技计划 2008SK3010 5、湖南省高校创新平台开放基金 09K074 6、湖南省卫生厅科研课题计划项目 B2008-067 目 录 一、 中 文 摘 要 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1 二、 英 文 摘 要 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 三、 前言 …… … …… …… … …… … …… …… … …… … …… …. 6 四、 正文 …… … …… …… … …… … …… …… … …… … …… …. 9 1. 材料与方法 …………………………………………………….. 9 2. 结果………………………………………………………… .…16 3. 讨论………………………………………………………………28 五、 结论……………………………………………………………33 六、 参考文献……………………………………………………...34 七、 综述……………………………………………………………38 八、 在读硕期间发表的论文……………………………………..47 九、 主要英文缩略语索引………………………………………..48 十、 致谢…………………………………………………………49 二烯丙基二硫下调 LIMK1 抑制人胃癌细胞增殖、 迁移及侵袭 中文摘要 目的：我们先前证明二烯丙基二硫（diallyl disulfide， DADS）可明显抑制人胃 癌细胞增殖，并且蛋白质组学研究发现 DADS 诱导人胃癌 MGC803 细胞的差异 蛋白质 LIMK 明显下调。近年来，LIMK1 对肿瘤细胞的增殖和侵袭的意义引起 了广泛关注。本研究旨在探讨 DADS 对人胃癌 MGC803 细胞 LIMK1 的表达及其 信号通路的影响，以阐明其抗肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的分子机制。 方法：DADS 作用人胃癌 MGC803 细胞后，采用 MTT 比色法检测对增殖影响； Transwell 实验和划痕实验分别观察 DADS 对细胞侵袭和迁移能力的影响；免疫 组化检测 LIMK1 的表达；RT-PCR、Western blot 分别检测 Rac1、Rock1、Pak1、 LIMK1、cofilin1 和 Destrin 的 mRNA 与蛋白表达。 结果： 1. DADS对人胃癌MGC803细胞的增殖、侵袭和迁移具有抑制作用 MTT 法检测结果显示，30 mg· L-1 DADS 作用 MGC803 细胞 24h、48h、72h、 96h 后，其吸光度值比对照组低，而且随时间增加逐渐降低(P0.05)；随着时间 增加，DADS 对癌细胞增殖的抑制率逐渐增加，依次为 31.8%，66.1%，83.6%， 89.2% (P0.05)，表明 DADS 对人胃癌细胞具有明显的生长抑制作用，且呈显著 的时间-效应依赖关系（P0.05）。 划痕实验结果显示，10、20、30、40、50 mg· L-1 DADS 分别作用 MGC803 细胞，取 0 小时和 24 小时观察划痕愈合情况，对照组划痕愈合显著快于 DADS 处理组，证明细胞的迁移能力被抑制，呈剂量-效应依赖关系（P0.05）。Transwell 实验结果显示，10、20、30、40、50 mg· L-1 DADS 分别作用 MGC803 细胞 24h 后，随机取 10 个高倍视野进行穿过基质胶的细胞计数，处理组分别为 35.8±3.74、 34.1±2.02、31.7±4.81、17.2±3.08、13.2±3.36 个，较对照组 39.5±2.99 个明显减少， 呈剂量依赖性（P0.05）。 2. DADS 对人胃癌 MGC803 细胞 LIMK1 的表达具有下调作用 RT-PCR 结果显示，30 mg·L-1 DADS 与 MGC803 细胞作用 48h 后，LIMIK1 mRNA 水平明显下调。Western blot 显示，30 mg·L-1 DADS 分别与 MGC803 细胞 作用 6、12、24、48 h 后，LIMK1 蛋白的表达水平呈时间依赖性下降，表明 DADS 可抑制人胃癌 MGC803 细胞 LIMK1 蛋白的表达。免疫组化检测显示 30 mg·L-1 DADS 分别与 MGC803 细胞作用 6、12、24、48 h 后，LIMK1 蛋白的表达呈时 间依赖性下降。 DADS 可抑制 cofilin1 的磷酸化水平，但对 Destrin 的表达无影响 RT-PCR 和 Western blot 结果均显示