仿刺参糖胺聚糖溶剂残留检测方法建立及免疫活性研究-药物化学专业论文.docxVIP

仿刺参糖胺聚糖溶剂残留检测方法建立 及免疫活性研究 摘 要 仿刺参（Apostichopus japonicus Selenka）广泛分布于我国北方海域，具有 较高的营养价值和经济价值。海参多糖是海参中重要的活性组分，具有多种生 物学功能和药理活性，在细胞的生命活动中发挥重要作用。仿刺参糖胺聚糖 （HGAG）作为海参多糖中的酸性多糖，其独特的分子结构和突出的免疫调节 活性，表现出广阔的药物开发前景。国内外有关海参及海参多糖的研究取得了 一定的进展，但仅局限于海参粗提物或粗多糖的初步活性筛选，尚未见有关 HGAG 的纯化分析及其免疫调节活性的系统报道。本文的主要目的是分离得到 纯化的 HGAG，分析醋酸根和乙醇溶剂残留，研究其在非特异性免疫和特异性 免疫等方面的免疫调节活性，为 HGAG 的开发应用奠定基础。 实验采用碱提取、酶解和乙醇沉淀得到仿刺参粗多糖；双氧水脱色、三氯 乙酸除蛋白得到仿刺参精制多糖；最后通过 Q-FF 阴离子交换柱层析和透析得 到纯化 HGAG。利用凝胶渗透色谱（GPC）进行分析鉴定，结果表明纯化得到 的 HGAG 纯度较高、分子量均一，重均分子量（Mw）为 94091。多糖提取分 离中有机溶剂的使用会造成醋酸根和乙醇的残留，因此分别建立了醋酸根和乙 醇的气相色谱测定方法，并进行了方法学验证，结果表明所建立的检测方法快 速、准确、可靠性高。利用建立的方法测得 HGAG 中醋酸根和乙醇的残留量分 别为 0.18%和 0.013%，符合《中国药典》中第三类有机溶剂残留限量 0.5% 的 要求。 为研究 HGAG 对非特异性免疫的调节作用，观察 HGAG 对小鼠腹腔巨噬 细胞（Mφ）功能的影响。不同浓度 HGAG 作用于体外分离培养的腹腔巨噬细 胞，倒置显微镜观察细胞形态变化，MTT 法测定细胞代谢活力，中性红测定吞 噬能力，试剂盒测定巨噬细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）和酸性磷酸酶（ACP） 活性，Griess 法测定一氧化氮（NO）产生，双抗夹心 ELISA 法测定培养上清中 TNF-α、IL-1β等细胞因子的分泌。结果表明，HGAG 在 0.1~25 μg·mL-1 范围内 I 对巨噬细胞有一定的促进作用；在 1~10 μg·mL-1 范围内与空白对照组相比可显 著增强巨噬细胞的代谢活力和吞噬能力（P 0.01），提高 LDH、ACP 酶活力和 NO 生成量（P 0.05），显著增加培养上清中 TNF-α和 IL-1β的浓度（P0.01）； 与阳性对照组相比，在 1~10 μg·mL-1 范围内对 Mφ吞噬功能以及 TNF-α、IL-1β 的生成有更好的促进作用（P 0.05）；在高浓度（100 μg·mL-1）Mφ各项功能指 标均低于空白对照组。说明 HGAG 在 1~10 μg·mL-1 浓度范围内可显著促进 Mφ 活性，并在一定程度上优于阳性对照组。表明 HGAG 能够激活 Mφ，促进机体 的非特异性免疫功能。 为研究 HGAG 对特异性免疫的调节作用，MTT 法测定脾淋巴细胞的增 殖，利用攻击前后足距肿胀度反应迟发型变态反应，利用血清溶血素和抗体生 成 细 胞 数 反 应 抗 体 产 生 量 和 B 淋 巴 细 胞 的 激 活 。 结 果 表 明 ， HGAG 在 0.05~25μg·mL-1 范 围 内 与 空 白 对 照 组 相 比 可 以 显 著 促 进 脾 淋 巴 细 胞 的 转 化 （P0.05），在 0.5~10 μg·mL-1 范围内促进作用高于阳性对照组（P 0.05）。 低、中、高剂量的 HGAG 均能促进迟发型变态反应，增加血清溶血素生成和抗 体生成细胞数（P 0.05），且高剂量组的作用效果优于中、低剂量组，具有一 定的浓度依赖性。表明 HGAG 对 T、B 淋巴细胞均有激活作用，并能增加抗体 的产生，促进机体的特异性免疫功能。 本论文分离纯化得到的 HGAG 分子量均一，有机溶剂残留符合要求，并且 具有良好的免疫调节活性。在非特异性免疫方面，可以从多个途径激活巨噬细 胞，促进巨噬细胞功能；在特异性免疫方面，可以促进细胞免疫和体液免疫， 激活 T、B 淋巴细胞，促进抗体合成与分泌，进而促进机体的免疫功能。 关键词：仿刺参糖胺聚糖；纯化分析；巨噬细胞；免疫活性 II Studies on the establishment of solvent residues detection methods and the immune activity of Apostichopus japonicus glycosaminoglycan Abstract Apostichopus japonicus Selenka is widely distributed in the sea of