多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩 β地中海贫血单细胞诊断中的应用研究-妇产科学专业论文.docxVIP

已经有许多对β地中海贫血和 SMA 进行植入前诊断的报道。如通过使用 单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、荧光 PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、巢 式 PCR、连锁分析结合微小测序等方法进行β地中海贫血的单细胞诊断和植入 前诊断；通过限制性酶切、等位基因特异性 PCR(allele-specific PCR, AS-PCR)、 荧光 PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、微小测序等方法进行 SMA 的植入前诊断。 然而上述的方法都基于单细胞诊断技术，因此具有一些缺点，如只能同时扩增少 量基因位点、样本不能保留、每种反应体系都需要进行优化、高等位基因脱扣率 (allele drop out, ADO)等。 为了解决这个问题，全基因组扩增技术(whole genome amplication, WGA)用 于扩增单细胞全基因组 DNA 已经引入到 PGD 之中。WGA 的方法有许多种，如 引物延伸预扩增聚合酶链反应(primer extension preamplification PCR, PEP-PCR)， 简并寡核苷酸引物聚合酶链反应 (degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR) ，多重链置换扩增 (multiple displacement amplification, MDA) 等。 PEP-PCR 和 DOP-PCR 都是基于 PCR 为基础的，因此其具有基因组覆盖不完全 高 ADO 率、扩增片段短不适用于需要高质量模板的后续基因分析方法等缺点。 MDA 是目前为止最好的 WGA 方法。其最早由 Lizardi 博士建立，主要基于 Phi29 DNA 聚合酶的恒温链置换扩增原理，具有恒温扩增、扩增片段长、基因组覆盖 度高等优点。 研究目的： 本研究通过使用 AS-PCR、微卫星分析、反向斑点杂交(reverse dot blot, RDB) 比较不同 MDA 孵育时间对扩增成功率、ADO 率影响，优化 MDA 的孵育时间。 同时通过结合 MDA、AS-PCR，微卫星分析对单细胞进行 SMA 诊断；结合 MDA、 RDB 对β地中海贫血进行诊断，建立结合 MDA 对单细胞进行 SMA 和β地中海 贫血诊断的方法，为日后建立 SMA、β地中海贫血的植入前诊断平台打下基础。 材料： 取本研究所建立的 5 株成纤维细胞系做为研究材料。其中，有两株 smn1 基 因纯合缺失成纤维细胞(S1 和 S2)；1 株β41-42/β17 双重杂合突变β地中海贫血 成纤维细胞(TH1)；1 株β41-42/β41-42 纯合突变β地中海贫血成纤维细胞 (TH2)；1 株正常人包皮成纤维细胞(N1)。这些细胞的突变类型均事先通过基因 检测明确诊断。共取得 49 个单个成纤维细胞。其中包括 13 个 TH1 单个成纤维 细胞，10 个 TH2 单个成纤维细胞，8 个 S1 单个成纤维细胞，10 个 S2 单个成纤 维细胞。8 个 N1 单个成纤维细胞。 方法: 1. 单个细胞制备 2. 将细胞分为 16 小时孵育组和 4 小时孵育组进行单细胞 MDA 扩增 3. 应用 AS-PCR 对 MDA 产物进行 smn1 和 smn2 基因的检测 4. 应用单重荧光 PCR 法对 MDA 产物扩增 smn1 基因紧密连锁的两个 STR 位点 D5S351、D5S435 5. 应用 RDB 法对 MDA 产物进行β地中海贫血的 18 种β地贫突变位点的检测 结果： 1. MDA 单个成纤维细胞的总扩增率 89.3%(342/383)，smn1 基因的总扩增成功 率为 90.48%(19/21)，smn2 基因的扩增成功率为 94.87% (37/39)。D5S351 和 D5S435 的扩增成功率分别为 94.87% (37/39)，87.18% (34/39)。结合 MDA、 STR、AS-PCR 对 SMA 进行 PGD 的总的扩增成功率为 92.02%(127/138)。RDB 检测扩增成功率为 88% (220/250)。总 ADO 率是 13.92%(11/79)，D5S351 的 ADO 率是 16.22% (6/37)，D5S435 的 ADO 率是 12.5%(2/16)，结合 MDA、STR、 AS-PCR 对 SMA 进行 PGD 的总 ADO 率为 15.09%(8/53)，RDB 的 ADO 率是 11.54%(3/26)。 2. 16 小时组与 4 小时组在扩增成功率方面分别为 90.48% (171/189) 和 88.14% (171/194)，结果无显著性差异(χ2 检验,P0.05)；1