多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海贫血单细胞诊断中的应用分析-妇产科学专业论文.docxVIP

多重链置换扩增在脊髓性肌萎缩、β地中海 贫血单细胞诊断中的应用研究 硕士研究生 陈晓林 指导老师 孙筱放 教授 中文摘要 β 地中海贫血和脊髓性肌萎缩是两种常见的单基因遗传病。其中β地中海贫 血是是我国南方常见的一种常染色体隐性遗传、血红蛋白异常性疾病，携带率约 为 2.8%。该病由于珠蛋白基因缺失或突变导致。β 珠蛋白基因簇位于人 11 号染 色体上，包含 5 个功能基因和 1 个假基因，这些基因的突变导致血红蛋白合成异 常而发病。全世界约发现 200 多种突变，我国大约有 28 种突变。地贫基因的突 变会导致贫血及后续的器官损害，严重危害人的生命。SMA 是一种常见的致死 性常染色体隐性遗传性疾病，其发病率约 1/6000-1/10000 。人群携带率约 1/40-1/50。染色体 5q13 的脊髓性肌萎缩运动神经元生存基因(survival motor neuron gene 1, smn1) 的缺失是导致 SMA 发病的主要病因。Smn1 基因的突变使 脊髓运动神经元退变而导致肌无力和肌萎缩，由于肌肉渐进性的退化，患者走路、 爬行、吞咽、甚至呼吸等功能都会逐渐丧失，常因呼吸衰竭而死亡。上面两种疾 病至今仍缺乏有效的治疗方法。现在一般使用产前诊断的方法来减少患儿的出 生。然而，产前诊断需要终止妊娠，给孕妇及家庭带来巨大的伤害。 胚胎植入前诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)是一种基于试管婴 儿的技术发展起来的不同于产前诊断的诊断方法。PGD 通过对体外授精形成胚 胎进行细胞活检，使用 PCR 或者荧光原位杂交等技术，进行遗传病的诊断，根 据结果移植合适的胚胎到宫腔中的一种技术，这种技术可以避免产前诊断所需要 的终止妊娠。根据欧洲人类生殖与胚胎协会 PGD 分会的统计，目前全世界实行 PGD 周期总数超过 20,000 例，成功分娩 6,000 多个健康胎儿。为许多患者夫妇 带来了希望。 已经有许多对β地中海贫血和 SMA 进行植入前诊断的报道。如通过使用 单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、荧光 PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、巢 式 PCR、连锁分析结合微小测序等方法进行β地中海贫血的单细胞诊断和植入 前诊断；通过限制性酶切、等位基因特异性 PCR(allele-specific PCR, AS-PCR)、 荧光 PCR(Fluorescence PCR, F-PCR)、微小测序等方法进行 SMA 的植入前诊断。 然而上述的方法都基于单细胞诊断技术，因此具有一些缺点，如只能同时扩增少 量基因位点、样本不能保留、每种反应体系都需要进行优化、高等位基因脱扣率 (allele drop out, ADO)等。 为了解决这个问题，全基因组扩增技术(whole genome amplication, WGA)用 于扩增单细胞全基因组 DNA 已经引入到 PGD 之中。WGA 的方法有许多种，如 引物延伸预扩增聚合酶链反应(primer extension preamplification PCR, PEP-PCR)， 简并寡核苷酸引物聚合酶链反应 (degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR) ，多重链置换扩增 (multiple displacement amplification, MDA) 等。 PEP-PCR 和 DOP-PCR 都是基于 PCR 为基础的，因此其具有基因组覆盖不完全 高 ADO 率、扩增片段短不适用于需要高质量模板的后续基因分析方法等缺点。 MDA 是目前为止最好的 WGA 方法。其最早由 Lizardi 博士建立，主要基于 Phi29 DNA 聚合酶的恒温链置换扩增原理，具有恒温扩增、扩增片段长、基因组覆盖 度高等优点。 研究目的： 本研究通过使用 AS-PCR、微卫星分析、反向斑点杂交(reverse dot blot, RDB) 比较不同 MDA 孵育时间对扩增成功率、ADO 率影响，优化 MDA 的孵育时间。 同时通过结合 MDA、AS-PCR，微卫星分析对单细胞进行 SMA 诊断；结合 MDA、 RDB 对β地中海贫血进行诊断，建立结合 MDA 对单细胞进行 SMA 和β地中海 贫血诊断的方法，为日后建立 SMA、β地中海贫血的植入前诊断平台打下基础。 材料： 取本研究所建立的 5 株成纤维细胞系做为研究材料。其中，有两株 smn1 基 因纯合缺失成纤维细胞(S1 和 S2)；1 株β41-42/β17 双重杂合突变β地中海贫血 成纤维细胞(TH1)；1 株β41-42/β41-42 纯合突变β地中海贫血成纤维细胞 (TH2)