促进rAAV在肺癌细胞中高表达的miRNA筛选及机制初探-生物学专业论文.docx

摘要 摘 要 研究背景 近年来，基因治疗取得长足的进展，全世界已有上千例基因治疗研究进入 临床试验，治疗的范围已从遗传病领域扩展到癌症、心血管疾病、神经系统疾 病、传染病（包括 AIDS）等领域。然而，呈递基因药物的载体的局限性阻碍了 基因治疗的发展。 rAAV（Recombinant Adeno-associated Virus）基因药物载体这一后起之秀格 外引人注目，腺相关病毒属于细小病毒家族，具有宿主范围广、非致病性、能 长期稳定表达外源基因等优点，被认为是最有前景的基因治疗载体之一。 一些临床研究的问题如血友病基因治疗中 AAV2 外壳启动了 CD8+T 细胞介 导的免疫反应，对肝细胞产生细胞毒性，缺陷、帕金森病的临床试验被证明基 本无效，对 rAAV 载体的表达效率提出了更高要求。 一些治疗基因，在发挥抗肿瘤作用的同时，还可提高载体的表达效率。2009 年 Johnson 等研究发现，siRNA 介导的沉默机制使 rAAV 载体的表达效率最高可 提高 15 倍和 30 倍。2011 年 Wallen 等从 5520 个 siRNA 文库中筛选出 50 个能提 高 rAAV 表达至 8 倍的 siRNA。 以上研究为本论文提供了良好的借鉴。miRNA 是一类长约 22nt 的小片段 RNA 分子，能够在转录后水平调控基因表达。它的异常表达与肿瘤发生关系密 切，尤其是在肺癌中的影响，引起强烈关注，并得到大量研究。 研究目的 本论文将探索 miRNA 在以 rAAV 作为载体的基因治疗中的作用，在小细胞 肺癌细胞 NCI-H446 细胞系中高通量筛选 miRNA 文库以发现促进 rAAV 表达的 miRNA 序列并利用生物信息学软件对明星 miRNA 进行靶点和信号通路预测， 探索其作用机理，为 rAAV-miRNA 的基因药物的研究打开一扇门。 研究方法 （1） 细胞培养，建立 NCI-H446 细胞系； （2） 脂质体转染法共转染 EGFP siRNA 和 EGFP 质粒以评估和建立良好的 转染体系； （3） 脂质体转染法转染包含近 2000 条序列的 miRNA 文库； （4） 转染 rAAV-GLUC 病毒，以 GLUC 荧光表达量来衡量 rAAV 的表达水 平； I 华侨大学硕士学位论文 （5） 用腔肠素（coelenterazine）配制工作液来检测 GLUC 荧光强度； （6） MTT 法检测转染体系中细胞增殖及活力； （7） 用稳健型 Z 评分，四分位法等统计学算法对筛选数据进行科学的统计 和结果鉴定，挑选出可以提高 rAAV 转染效率的 miRNA； （8）使用生物信息学软件如 Targetscan，Pictar，DAVID 等对筛选出的 miRNA 进行靶基因和信号通路预测，以进一步探究 miRNA 作用机理。 研究结果 （1） 重复两次完成了近 2000 个 miRNA 序列文库的筛选，获得了信息量丰 富的数据，并挑出了促进 rAAV 高表达的 miRNA 分子； （2） 对初筛的 miRNA 进行生物学验证，证实了初筛的结果； （3） 根据生物信息软件预测结果分析讨论了 miRNA 参与 rAAV 转染过程 的可能机制。 关键词： 重组腺相关病毒 microRNA 基因治疗 肺癌 II Abstract Background Abstract In recent years, gene therapy has made great progress. Thousands of clinical trials have been conductetd so far. Its application has extended to a variety of diseases. However, limitation in vectors becomes a major hurdle for further development of gene therapy. rAAV，with the adavantages of a wide host range, non-pathogenicity, stable and long-term expression of exogenous gene,is deemed the most promising gene therapy vectors. A number of problems in clinical trials such as CD8 T cell-mediated immune response and cytotoxic effect in liver cells caused by AAV2, invalidity in Parkin