凡纳滨对虾性腺抑制激素定位及激素对性腺发育基因表达影响-海洋生物学专业论文.docxVIP

凡纳滨对虾性腺抑制激素定位及激素对性腺发育相 关基因表达的影响 摘 要 性腺抑制激素（Gonad inhibiting hormone，GIH）是甲壳动物 X 器官窦腺复 合体（XO-SG complexs）合成分泌的一种重要的神经多肽激素，对雌性和雄性 的性腺发育起抑制作用。本文以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象， 利用 SMARTer RACE 技术克隆 GIH 的 5’UTR（包含部分 ORF），利用生物信息 学对 GIH 序列和结构进行了分析预测，通过免疫组化技术研究了 GIH 蛋白在眼 柄中的表达和分布，用荧光定量 PCR 技术检测了雌激素对 GIH 及眼柄激素对其 它性腺发育相关基因（DMC1 、VASA 和 VTG）表达的影响，主要结果如下： 1. GIH 基因的序列分析 凡纳滨对虾 GIH cDNA 序列由 865 个核苷酸组成，其中 5’端非编码区（5’UTR） 有 56bp，3’UTR（包括 poly（A））有 521 bp，开放阅读框（ORF）有 288bp，共 编码 96 个氨基酸（包括 17 个氨基酸信号肽）。同源比对与进化关系显示，凡纳 滨对虾 GIH 与斑节对虾 GIH 亲缘关系最近，同源性高达 94%，与刀额新对虾同 源性达 63%，而与欧洲龙虾、美洲鳌虾、拟穴青蟹、青虾和鼠妇等甲壳动物 GIH 同源性均低于 45%，与日本囊对虾、南美蓝对虾及中华绒螯蟹蜕皮抑制（MIH） 同源性分别为 77%、93%、89%。 凡纳滨对虾 GIH 蛋白分子量为 11158.05Da，等电点为 9.15；其中 Leu (L)含 量最高，达到了 13.5%，Arg (R)含量为 11.5%，Asn (N)含量为 8.3%；GIH 存在 两种可能的跨膜结构，一种在从内到外第 3-20 位氨基酸 α 螺旋处，另一种在从 外到内为第 1-20 位的氨基酸 α 螺旋处；前 17 个氨基酸为信号肽；GIH 亚细胞 77.8%主要定位在细胞外（包括细胞膜），11.1%存在于空泡中，11.1%存在于内 质网中；用 SWISS-MODLE 在线软件预测凡纳滨对虾 GIH 成熟肽的 3D 结构， 发现 GIH 预测蛋白由五段 α 螺旋，结构简单，与斑节对虾 MIH 结构类似。 2.GIH 免疫组化分析 GIH 分泌细胞主要定位在 XO-SG，少量定位在神经轴索中。XO 中 GIH 分 泌细胞主要定位在端髓和内髓，SG 中 GIH 分泌细胞定位在外髓，且 XO 和 SG 荧光强度相近。 3. 雌二醇对 GIH 表达的影响 GIH 的表达量随凡纳滨对虾卵巢发育逐渐降低；雌二醇抑制眼柄 GIH 的表 达，且分别与处理时间和浓度存在正相关。 I 4.摘除眼柄与注射眼柄提取物对生殖相关基因表达的影响 DMC1 和 VASA 只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中组织表达。摘除眼柄后，精巢 和卵巢中 DMC1 表达量均显著性降低（P0.05），而注射眼柄激素后精巢和卵巢 中 DMC1 表达显著增高（P0.05）；相反，摘除眼柄后，精巢和卵巢中 VASA 以 及卵巢中 VTG 表达量显著增高，而注射眼柄激素后 VASA 和 VTG 表达量显著降 低。 结果表明凡纳滨对虾 GIH 序列属于 CHH 家族 II 类多肽激素，与斑节对虾同 源性最高，亲缘关系最近；GIH 蛋白主要定位在 XO-SG 中，分散在端髓和外髓 处，XO 与 SG 荧光强度相近；17β-雌二醇对 GIH 存在负调控作用，并随处理时 间和处理剂量 GIH 表达降低；眼柄粗提物可促进 DMC1 但抑制 VASA 和 VTG 的 表达。 关键词:凡纳滨对虾，性腺抑制激素，免疫定位，雌二醇，DMC1，VASA，VTG Localization of Gonad-inhibiting Hormone in the Eyestalk and Effects of Hormones on Gonad Development Related Genes Expression in Litopenaeus vannamei Abstract Gonad-inhibiting hormone (GIH) is one of an important neuropeptide family hormone, which synthesized and released in X-organ-sinus gland (XO-SG) complex of crustacean eyestalks, and inhibited the gonad maturation of males and females crustacean. In this study, cDNA encod