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二穗短柄草BdWRKY55和BdWRKY83基因的克隆、表达分析及遗传转化研究-生物工程专业论文
独创性声明
本人声明所呈交的学 位论文是我个 人在导师指导下 进行的研究工 作及取得 的研究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果 。对本文的研究 做出贡献的个人和集 体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
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本论文属于
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学位论文作者签名: 指导教师签名:
日期: 年 月 日 日期: 年 月 日
摘 要
各种非生物逆境胁迫包括干旱、高盐、极端温度等严重影响植物的正常生长和 发育,特别是对农作物产量和品质的影响尤为突出。植物在长期进化过程中形成了 精细的调节机制,如通过转录因子激活或抑制下游基因的表达,调控胁迫响应相关 基因的表达,进而适应这些不良的环境变化。高等植物基因组中包含几十个转录因 子家族,WRKY 转录因子家族就是其中之一。二穗短柄(Brachygodium distachyon) 是新兴的禾本科模式生物,与小麦具有较近的亲缘关系,因此对二穗短柄草 WRKY 基因的克隆以及功能研究,有助于麦类作物 WRKY 基因功能研究及遗传改良。
本研究以二穗短柄草为实验材料,成功克隆了 BdWRKY55 和 BdWRKY83 两个基 因;利用半定量 RT-PCR 技术检测了这两个 BdWRKYs 基因在非生物逆境胁迫及信号 分子处理下的表达变化;通过基因枪轰击洋葱表皮细胞获得这两个转录因子-GFP 融 合蛋白在洋葱细胞中的亚细胞定位情况;利用农杆菌介导的遗传转化技术,获得了 两个 BdWRKYs 基因过表达的转基因烟草。具体研究内容和结果如下:
(1)通过对二穗短柄草基因组序列检索分析,采用 RT-PCR 技术,克隆了两个 WRKY 基因家族成员,并分别命名为 BdWRKY55 和 BdWRKY83;序列比对分析表明, 二者均属于类型 III WRKY 成员。
(2)通过洋葱表皮细胞的瞬时表达实验对 BdWRKY55 和 BdWRK Y83 转录因 子进行了亚细胞定位分析,结果显示这两个转录因子均定位于细胞核。
(3)通过半定量 RT-PCR 检测了 BdWRKY55 和 BdWRKY83 基因在二穗短柄草 不同器官的表达情况和在干旱、高盐、极端温度等非生物逆境胁迫以及 ABA 和 H2O2 信号分子处理下的表达水平变化。结果表明,在检测的所有组织中,BdWRKY55 和 BdWRKY83 均有不同水平的表达,但二者均在叶片中表达量最高。BdWRKY55 和 BdWRKY83 基因对不同的逆境胁迫及信号分子处理有不同的响应,PEG、ABA、H2O2、 冷和热处理对 BdWRKY55 基因的表达有不同程度的下调,除冷处理外,其余处理均 能上调 BdWRKY83 基因的表达。
(4)利用农杆菌介导的遗传转化技术,获得了 BdWRKY55 和 BdWRKY83 基因
过表达的转基因烟草。初步表型分析结果表明,过表达 BdWRKY83 可提高转基因烟 草对干旱胁迫的耐受性。
以上研究结果为进一步揭示 BdWRKY55 和 BdWRKY83 基因的生物学功能奠定了 基础。
关键词:二穗短柄草,WRKY 转录因子,非生物胁迫,表达分析,瞬时表达,遗传 转化
Abstract
Various abiotic stresses including drought, high salinity, extreme temperature, etc. severely affect plant growth and development, and decrease the productivity and quality of crops. During long-time evolution process, plants have developed elaborate metabolisms
e.g. by activating transcriptional factors to enhance or inhibit downstream genes’ expression, and adapt to those environmental changes. WRKY transcriptional factors h
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