儿童重症监护室肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株的耐药基因及其流行病学研究-病原生物学专业论文.docxVIP

定，了解我院 PICU 分离肺炎克雷伯菌产 ESBLs 菌株的基因型及其流行情况，分 析我院 PICU 肺炎克雷伯菌产 ESBLs 菌株感染暴发或流行的危险因素，探讨其防 制措施。 一、 产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药表型研究. 目的：了解产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的敏感性及其规 律。 材料与方法 （一 ） 材料 1．标本来源：贵阳市儿童医院（以下简称“我院”）2013 年 4-12 月期间在 儿童重症监护室住院患儿，采集其深部痰液、血液、胸腹腔积液、创面分泌物等 标本，排除同一患者同一部位重复分离的菌株，分离非重复肺炎克雷伯菌。 2．试剂： 2.1 药敏试纸：阿莫西林（AMX），氨苄西林（AMP），氨苄西林／舒巴坦 （SAM），哌拉西林/他唑巴坦（TZP），头孢唑啉（KZ），头孢呋辛(CXM)，头孢 孟多（MA），头孢曲松（CRO），头孢替坦(CTT)，头孢他啶(CAZ)，头孢吡肟(FEP)， 庆大霉素(CN)，妥布霉素(TOB)，氧氟沙星（OFX），左氧氟沙星（LEV），环丙 沙星（CIP），氨曲南（ATM），呋喃妥因(F)，复方新诺明（SXT），亚胺培南（IPM）， 厄他培南（ETP），分别由英国 Oxoid 公司提供。 2.2 培养基：血琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，M-H 琼脂培养基，由广州 迪景生物有限公司提供。 3．仪器：美国 BD 公司 9120 全自动血培养仪，法国生物-梅里埃细菌 VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定仪。 （二 ）方法 1．肺炎克雷伯菌的分离与鉴定：痰液、尿液、胸腹水、创面分泌物等标本 按《全国临床检验操作规程》接种血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基培养分离得 到纯菌，通过法国生物梅里埃 VITEK-Compact 全自动细菌鉴定仪及其配套的 GN13 板鉴定。血液标本先用美国 BD 公司生产的 9120 全自动血培养仪及其配套 培养瓶培养阳性后，转种血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基培养，分离纯培养菌 株，用法国生物梅里埃 VITEK-Compact 全自动细菌鉴定仪及其配套的 GN13 板 鉴定。 2．产 ESBLs 肺炎克雷伯菌耐药表型检测：用肉汤稀释法测定分离菌株的抗 菌药物 MIC，按 CLSI2012 推荐的筛选和确认产超广谱β-内酰胺酶的标准进行 判断。 2.1 双纸片协同法（初筛试验）：将 0.5 麦氏单位的待检菌液用无菌棉签涂抹 于 MH 琼脂平板上，稍干后，把含 10μg 片克拉维酸纸片（Clavulanic Acid，CLA） 贴于 MH 平板中央，于克拉维酸纸片周围分别贴上头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲 松、氨曲南、头孢泊肟纸片（纸片中心距离为 20~24mm），置 35℃过夜培养，观 察有无协同现象，CLA 与任何一种超广谱β-内酰胺类抗生素（ESC）有协同现 象（即 ESC 在 CLA 这边的抑菌圈变大）者可疑为产 ESBL 菌株。 2.2 双纸片增效法（确认试验）将 0.5 麦氏单位的待检菌液用无菌棉签涂抹 于 MH 琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基上分别贴头孢他啶/克拉维酸、头孢 噻肟/克拉维酸、头孢曲松/克拉维酸、氨曲南/克拉维酸、头孢泊肟/克拉维酸纸片， 置 35℃过夜培养后量取抑菌环直径，与单纸片平皿对照，若加克拉维酸纸片较 未加克拉维酸纸片抑菌环直径≥5mm，即 ESBLs 阳性。 3．药敏试验：采用纸片扩散法，将分离的肺炎克雷伯菌用生理盐水配制成 0.5 麦氏单位悬菌液（含菌量约 1.5×108 CFU /ml）,用无菌棉签将菌液均匀涂布 于直径 90mm 的 M-H 琼脂培养基中，再将药敏纸片贴在 M-H 琼脂表面上，每个 平板贴 6 张药敏纸片。37℃孵育 18～24 小时后取出，测量抑菌圈直径。以大肠 埃希菌 ATCC25922 为阴性质控菌、肺炎克雷伯菌 ATCC700603 作为阳性质控菌， 均购于卫生部临床检验中心。结果判断参照 2012 年美国临床实验室标准化委员 会(CLSI)药敏试验判断标准。 4．统计学分析：耐药率比较采用 SPSS19.0 统计软件系统进 X2 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。 结果 一. 肺炎克雷伯菌产 ESBLs 的阳性率 2013 年 4-12 月从我院 PICU 送检的细菌培养标本中分离到肺炎克雷伯菌 44 株， 标 本 来 源 包 括 痰 、 血 液 及 创 面 分 泌 物 等 ， 其 中 痰 为 主 要 标 本 来 源 占 95.4%(42/44)。在 44 株肺炎克雷伯菌中，检出产 BSBLs 菌 29 株，阳性率达 65.9%。 二. 肺炎克雷伯菌产 ESBLs 菌株和非产 ESBLs 菌株的耐药性 1.1 产 ESBLs 菌株的耐药性：肺炎克雷伯菌产 E