反复超排卵对小鼠卵母细胞印记基因DNA 甲基化的影响及机制研究-临床医学专业论文.docxVIP

学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 日期： 年 月 III 反复超数排卵对小鼠卵母细胞印记基因 DNA 甲基化 的影响及机制研究 摘 要 研究生 王 倩 导 师 张翠莲 郑州大学人民医院 生殖研究所 中国 郑州 450003 背景与目的 辅助生殖技术中，为获得足够的卵母细胞，外源性促性腺激素被广泛应用， 部分病人需要多次促排卵以获得活产胎儿。研究表明外源激素的使用对卵母细 胞质量有不利影响，如非整倍性增加等。对动物的研究表明高剂量外源激素对 卵母细胞 DNA 甲基化建立有不利影响，而低剂量外源促性腺激素对卵母细胞 DNA 甲基化没有明显影响。但低剂量多次超数排卵是否会影响卵母细 DNA 甲 基化修饰却并不清楚。本研究以反复超排小鼠为模研究低剂量多次超排对卵母 细胞印记基因的 DNA 甲基化水平的影响及可能机制。 材料和方法 采用健康 6 周龄 CD-1 小鼠 30 只进行实验，实验组和对照组各 15 只，随 机分配。实验组分为：R1：超排 1 次组，腹腔注射 PMSG 8IU/只，48 小时后注 射 8IU HCG；R3:超排 3 次组，每隔 1 周超排 1 次，连续超排 3 次，超排方法 如 R1；R5：超排 5 次组，每隔 1 周超排 1 次，连续超排 5 次。对照组为 C1、 C3、C5 分别注射等体积的生理盐水。 运用 结 合 重 亚 硫 酸 盐 的 限 制 性 内 切 酶 法 (combined bisulfite restriction analysis，COBRA)分析卵母细胞印记基因 DNA 甲基化水平，运用 Q-PCR 绝对 定量分析颗粒细胞线粒体 copy,相对定量分析线粒体编码的电子呼吸传递链基 I 因的 mRNA 水平并检测了卵巢指数，同时监测小鼠的发情周期运用免疫组化检 测原始卵泡所占比例，并行卵母细胞体外成熟检测第一极体排出率。 结果 1、随超排次数的增加，父源印记基因 H19 的甲基化水平并未发生改变， 母源印记基因 Peg3 的甲基化水平下降。 2、随促排次数的增加，线粒体的 copy 数下降。 3、核编码的 DNA 聚合酶 mRNA 和第 2 外显子 DNA 甲基化水平检测发现： R1、R5 PolgA 的 DNA 甲基化水平略低于 R3, 颗粒细胞 PolgA mRNA 表达水 平的变化与 DNA 甲基化水平的变化是一致的。 4、反复超排改变了颗粒细胞线粒体编码的氧化呼吸相关基因 COX1、 CYTB、 ND2 、ND4 的表达。 5、随着促排次数的增加，小鼠的卵巢指数增加。其中 R5 和 C5，R1 和 C1 相比，有显著性差异（P0.05）R5 和 R1 促排相比，也有显著差异（P0.05）。 随着促排次数的增加，原始卵泡比例下降, 小鼠的卵巢储备功能下降，对照组 各组之间无统计学差异，R5 和 C5 相比，也有显著性差异（P0.05），实验组 R3 和 R1，R3 和 R5 有显著差异（P0.05）；随着促排次数的增加，各对照组 和实验组小鼠卵母细胞的第一极体排出率也是下降的 ，随促排次数的增加，实 验组的第一极体排出率低于对照组，但无统计学差异。 结论 随促排次数的增加，小鼠颗细胞线粒体功能改变可能是导致卵母细胞的 DNA 甲基化水平降低的原因，同时小鼠的卵巢指数增加，储备功能下降，卵母细胞 成熟率下降。 关键词：反复超促排，卵巢储备，体外成熟 ,线粒体拷贝数，DNA 甲基 II Effect of multiple superovulation on imprinted DNA methylation and possible mechanisms of oocyte postgraduate: Wang Qian Supervisor: Zhang Cuilian Reproductive Medical